PrimeScript™ High Fidelity RT-PCR Kit

A-1. 下記に示す反応液を調製する。

試薬		使用量
dNTP Mixture（10 mM each）		1 μl
Oligo dT Primer (2.5μM) 　or Random 6 mers(20μM) 　or Specific Primer (2μM)*1		1 μl
Template RNA*2 　（or Positive Control RNA		［4×105 copies］）
RNase Free dH2O		up to 10 μl

*1　反応に用いるプライマーはOligo dT Primer、Random 6 mers、特異的下流プライマー（Control RNA の場合はR-1 Primer）のいずれかを選択。
*2　Template RNAは、8 μlまで持ち込むことができる。total RNAの場合、6 μgまで使用可能（推奨使用量；100 pg～1 μg）。

A-2. 調製済みのチューブをサーマルサイクラーにセットし、次のプログラムで変性・アニーリングを行う。

65℃、5 min. 4℃

＜重要＞この変性・アニーリング操作により、鋳型RNA の変性と、逆転写プライマーの鋳型RNA への特異的なアニ－リングが効率的に行われ、逆転写効率が向上する。

A-3. 変性・アニーリング済み反応液に以下のように試薬を添加する。

試薬	使用量
A-2 の変性・アニーリング済み反応液	10 μl
5×PrimeScript Buffer	4 μl
RNase Inhibitor (40 U/μl)	0.5 μl
PrimeScript RTase	0.5 μl
RNase Free dH2O	5 μl
	20 μl

A-4. チューブをサーマルサイクラーにセットし、次のプログラムで逆転写反応を行う。

（30℃	10 min.）*3
42℃（～ 50）℃	15～30 min.
95℃	5 min.*4
4℃

*3	逆転写反応にRandom 6 mersを用いる場合に行う。この操作によりRandom 6 mersが鋳型RNAと42℃（～50℃）で充分アニーリングできる長さになるまで伸長し、逆転写効率が向上する。
*4	長鎖を増幅する場合は、1stストランドcDNAにニックなどのダメージを与えないように、70℃、15 minの失活操作を行うとよい。

＜重要＞
PrimeScript RTaseは、高次構造に強い伸長性を示すので、通常の反応は42℃で行う。特異的下流PCRプライマーを逆転写プライマーとして使用した場合、ミスプライミングによる非特異的な増幅産物できることがある。そのような場合は、反応温度を50℃にすることにより改善がみられる。

B-1. 下記に示す反応液を調製する。

試薬	使用量	最終濃度
PrimeSTAR Max Premix（2×）	25 μl	1×
上流Primer（20 μM）*5（センス）	0.5 μl	0.2 μM
下流Primer（20 μM）*6（アンチセンス）	0.5 μl	0.2 μM
A-4 の逆転写反応液	≦5 μl
滅菌精製水	up to 50 μl

*5 Positive Control RNA の場合、F-1 Primer
*6 Positive Control RNA の場合、R-1 Primer

B-2. 調製したチューブをサーマルサイクラーにセットし、至適プログラムでPCRを行う。

一般的な反応条件					Positive Control RNA の場合*7
98℃	10 sec.		30 cycles		98℃	10 sec.		30 cycles
55℃	5 or 15 sec.				55℃	5 sec.
72℃	1 min. / kb				72℃	30 sec.

*7	逆転写反応にOligo dT Primer、Random 6 mers、R-1 Primerのいずれを用いた場合も、Control Primer F-1とR-1を用いたPCRで、462 bpの増幅産物が得られる。