PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit

【標準プロトコール】

1. マイクロチューブ内で以下の液を混合する。
   

   試薬	使用量
   Oligo dT Primer（50 μM） 　or Random 6 mers（50 μM）	1 μl 　or 1 μl（0.4 ～ 2 μl）*1
   dNTP Mixture（10 mM each）	1 μl
   鋳型RNA	total RNA：5 μg以下*2 polyA+ RNA：1 μg以下
   RNase Free dH2O	up to 10 μl

   
   
2. 65℃で5分間保温した後、氷上で急冷する。
   ＜重要＞ この操作により鋳型RNAが変性し、逆転写効率が向上します。
3. 以下の反応液を加え、全量を20 μlにする。
   

   試薬	使用量
   2. の変性済み混合液	10 μl
   5 × PrimeScript Buffer	4 μl
   RNase Inhibitor (40 U/μl)	0.5 μl (20 U)
   PrimeScript RTase (200 U/μl）	1.0 μl (200 U)
   RNase Free dH2O	up to 20 μl

   
   
4. 穏やかに撹拌する。
   
   
5. 速やかに以下の条件で反応を行う。
   

   30℃		10	min.（Random 6 mers 使用時のみ）
   42℃（50℃）*3		30～60	min.

   
   
6. 95℃で5分間^*4保温（酵素の失活）した後、氷上で冷却する。
   
   

   *1	2 kb以上の鎖長のcDNAをランダムプライマーで合成する場合は0.4 μl（20 pmol）、リアルタイムPCRの鋳型をランダムプライマーで合成する場合は2 μl（100 pmol）を使用することで良好な結果が得られます。Gene Specific Primerも使用可能です。その場合、最終濃度0.1 μMとなるように反応系に加えてください。
   *2	リアルタイムRT-PCRの鋳型として用いるために1st strand cDNA合成を行う場合には、使用するtotal RNA量を1 μg以下としてください。
   *3	PrimeScript RTaseは高次構造にも強い伸長性を示すので、通常の反応は42℃を推奨します。RT-PCRにおいて、PCR下流プライマーを逆転写プライマーとして使用するとミスプライミングによる非特異的な増幅産物が生じる場合がありますが、そのような場合には逆転写反応温度を50℃にすることで改善が見られることがあります。
   *4	長鎖を増幅する場合は、1st strand cDNAにニックなどのダメージを与えないように、70℃、15分の失活操作を行ってください。