Multiplex PCR Assay Kit

A. マルチプレックスPCR
(1)以下の反応液を、0.2 ml反応チューブに調製する。

Multiplex PCR Mix 2	25 μl
primer mix*	適宣
Multiplex PCR Mix 1	0.25 μl
template DNA	適宣
dH2O	up to 50 μl

*	各プライマーは、通常それぞれが最終濃度0.2μMになるように加える。 反応によっては使用量を変化させることで結果が改善されることがある。

(2)Thermal Cyclerにセットし、以下の反応条件で反応を行う。

(3)	反応後、反応液の一部を電気泳動などで解析する。1 kbまでのマルチプレックスPCRの場合、3～4％アガロースゲル（PrimeGel Agarose PCR-Sieve（製品コード 5810A）など）を使用すると、それぞれの増幅産物を分離良く泳動することができる。

B. PCRの特異性を上げたい場合（プライマー1対を使用）
(1)以下の反応液を、0.2 ml反応チューブに調製する。

Multiplex PCR Mix 2	25 μl
primer #1（20 pmol/μl）	0.5 μl
primer #2（20 pmol/μl）	0.5 μl
Multiplex PCR Mix 1	0.25 μl
template DNA	適宣
dH2O	up to 50 μl

(2)Thermal Cyclerにセットし、以下の反応条件で反応を行う。

94℃, 30 sec.
↓
94℃, 30 sec.
55～60℃, 10～15 sec.*1		30～40 cycles
72℃, x sec.*2

あるいは、

↓
94℃, 30 sec.		30～40 cycles
65℃, x sec.*2

*1：	アニーリングの時間は短めに設定する。
*2：	1 kbまでは、1分を目安に設定する。1 kb以上の増幅を行う場合は、1 kbにつき2分を目安に設定する。

(3)反応後、反応液の一部を電気泳動などで解析する。