TB Green^® Premix DimerEraser™ (Perfect Real Time)

1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
   

   ＜1反応あたり＞

   試薬	使用量	最終濃度
   TB Green Premix DimerEraser（2×）	10 μl	1×
   PCR Forward Primer（10 μM）	0.6 μl	0.3 μM*1
   PCR Reverse Primer（10 μM）	0.6 μl	0.3 μM*1
   template（<100 ng）	2 μl	*2
   滅菌精製水	6.8 μl
   Total	20 μl

   *1 最終primer濃度は0.3 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題がある時は0.2～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

   *2 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA（RT反応液）をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10％以下になるようにする。

2. 反応を開始する。
   PCRは、下記の3 step PCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
   反応性に問題がある場合には、下記の「PCR反応条件について」を参考に最適なPCR条件を検討してください。
   
   ＜Light Cycler＞
   
   Stage 2：PCR反応

   3 step PCR 標準プロトコール
   Stage 1：初期変性
   　　30秒　　20℃／秒
   　　1サイクル
   
   Stage 2：PCR反応（左図）
   　　95℃ 5秒　　20℃／秒
   　　55℃ 30秒　　20℃／秒
   　　72℃ 30秒　　20℃／秒
   　　40サイクル
   
   Stage 3：融解曲線分析
   　　95℃ 0秒　　20℃／秒
   　　65℃ 15秒　　20℃／秒
   　　95℃ 0秒　　0.1℃／秒

＜ LightCycler 480システム＞
3 step PCR標準プロトコール
Denature
95℃ 30秒（Ramp Rate 4.4℃/sec.）
1サイクル
PCR
Analysis Mode：Quantification
95℃ 5秒（Ramp Rate 4.4℃/sec.）
55℃ 30秒（Ramp Rate 2.2℃/sec.）
72℃ 30秒（Ramp Rate 4.4℃/sec.、Acquisition Mode : Single）
40サイクル
Melting
Analysis Mode：Melting Curves
95℃ 5秒（Ramp Rate 4.4℃/sec.）
60℃ 1分（Ramp Rate 2.2℃/sec.）
95℃ （Ramp Rate 0.11℃/sec.、Acquisition Mode : Continuous、Acquisitions : 5 per℃）
1サイクル
Cooling
50℃ 30秒（Ramp Rate 2.2℃/sec.）
1サイクル



※使用上の注意
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃（5～）15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。



3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
   解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書をご参照ください。

PCR反応条件について

初期変性

PCR 条件と反応特異性

PCR条件と増幅効率