MightyAmp™ for Real Time (TB Green^® Plus)

1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
   ＜1反応あたり＞
   

   試薬	使用量	最終濃度
   MightyAmp for Real Time（TB Green Plus）(2×)	10 μl	1×
   PCR Forward Primer (10 μM)	0.4 μl	0.2 μM*1
   PCR Reverse Primer (10 μM)	0.4 μl	0.2 μM*1
   template (＜100 ng)	2 μl	*2
   滅菌水	7.2 μl
   Total	20 μl

   *1 最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題がある時は0.1～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

   *2 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA (RT反応液) をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10％以下になるようにする。




2. 反応を開始する。
   PCRキャピラリーを遠心機で軽く遠心後、LightCyclerにセットし、反応を開始する。
   * PCR反応は、下記の標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化する。PCR条件を至適化する場合は下記の「PCR条件について」を参照してください。
   
   
   

   　標準プロトコール
   
   　　Stage 1：初期変性
   　　　　98℃　　2分　　20℃／秒
   　　　　1サイクル
   
   　　Stage 2：PCR反応
   　　　　98℃　　10秒　　20℃／秒
   　　　　60℃　　15秒　　20℃／秒
   　　　　68℃　　1分/kb　20℃／秒
   　　　　　　　　　　（500 bp以下は30秒）
   　　　　40サイクル
   
   　　Stage 3：融解曲線分析
   　　　　95℃　　 0秒　20℃／秒
   　　　　65℃　　15秒　20℃／秒
   　　　　95℃　　 0秒　0.1℃／秒
   
   
   

   ※使用上の注意
   本製品に使用しているMightyAmp DNA Polymeraseは強力なホットスタート抗体を使用しているので、必ず98℃、2分の初期変性を行い、抗体を熱変性させてください。



3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
   解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書をご参照ください。

PCR条件について