核酸抽出

FFPEサンプルからのDNA抽出方法（NucleoSpin® DNA FFPE XS、Paraffin Dissolverを用いる場合）

NucleoSpin DNA FFPE XS（製品コード 740980.10、740980.50、740980.250）

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試薬の準備
　 Proteinase K溶液＊1，Wash Buffer B5＊2が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。
サンプルの準備
　ホルマリン固定パラフィン包埋切片＊3を用意し、1.5 mlマイクロチューブ（各自で用意）に入れる。
1. 脱パラフィン処理
Paraffin Dissolver 400 μlを添加し、60℃で3分間保温する。
すぐにvortexで激しく撹拌し、パラフィンを完全に溶解する。
室温に戻るまで、放置する。
2. サンプルの溶解
Buffer FL 100 μlを添加し、vortexで激しく撹拌する。
11,000×g、1分間遠心する＊4。
　 Proteinase K溶液＊1 10 μlを直接下層（水層）に添加し、ピペッティングにより混合する（下層のみをピペッティングし、上層と下層が混じらないように注意する）。
室温で3時間静置して、サンプルを溶解する＊5。
vortexで5秒間撹拌する。
3. 脱クロスリンク
Decrosslink Buffer D-Link 100 μlを添加し、vortexで緩やかに撹拌して、Buffer D-Linkと下層（水層）を混合する。
11,000×g、30秒間遠心する。

90℃で正確に30分間保温する。
vortexで5秒間撹拌した後、室温になるまで放置する（約2分間）
蓋に水滴がついている場合は、スピンダウン（1,000×g、1秒間程度）を行う。
4. エタノールの添加
96～100％エタノール200 μlを添加し、vortexで5秒間×2回混合する。
軽くスピンダウン（1,000×g、1秒間程度）して＊6、界面をクリアにする。
5. カラムへの吸着
NucleoSpin FFPE DNA Column（緑色のリング）をCollection Tube（2 ml）にセットする。ピペットで4の下層（水層）を全て吸い上げ＊7、カラムに添加する。
2,000×g、30秒間遠心する。
カラムに液が残っている場合は、続いて11,000×g、30秒間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube（2 ml）にセットする。
6. メンブレンの洗浄
1回目の洗浄
Buffer B5＊2　400 μlをカラムに添加し、11,000×gで30秒間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube（2 ml）にセットする。
2回目の洗浄
Buffer B5＊2　400 μlをカラムに添加し、11,000×gで2分間遠心してメンブレンを乾燥させる。
カラムを新しいマイクロチューブ（各自で用意）にセットする。
7. DNAの溶出
Buffer BE 20 μlを直接カラムのメンブレンに加える。
11,000×gで30秒間遠心する。
8. エタノールの蒸発
（オプション）
　 溶出液に残存しているエタノールを蒸発させるため、マイクロチューブの蓋をあけて90℃で8分間＊8保温する。
＊1Proteinase K溶液
製品コード 740980.10（10回用）の場合：Proteinase K（凍結乾燥品）1 vialにProteinase Buffer PB 260 μlを加えて溶解する。調製したProteinase K溶液は－20℃で6ヵ月間安定である。
＊2 Buffer B5
Wash Buffer B5（concentrate）に、4倍量のエタノール（96～100％）を添加する。調製後のWash Buffer B5は室温で1年間安定である。
＊3 1回の精製に使用するサンプル量は、パラフィンとして15 mg（約17 μl）、組織重量として5 mgまでが望ましい。
250 cm2、10 μm厚のホルマリン固定パラフィン切片の場合は7枚まで使用できる。
20 mm×25 mm、10 μm厚の切片（組織含量が少ない場合）は、3枚分でパラフィン約15 mgに相当する。
20 mm×25 mm、10 μm厚の切片(ほぼ全面が組織の場合)は、1枚で組織5 mgに相当する。
＊4 遠心によってサンプル液は下層（水層）と上層（有機層）の二層に分離し、組織成分は下層（水層）に移行する。ここで上層（有機層）を除いてもよい（オプション）。
＊5 溶解していないサンプルが残っている場合は、Proteinase K溶液10 μlを追加し、さらに3時間～1晩静置する。
（ここで操作を中断することが可能である。その場合は反応液を-20℃で保存する）。
＊6 強く遠心するとDNAが沈殿する可能性があるので注意する。
＊7 ピペットで450 μl程度を吸い上げ下層の液を全て回収する（通常、下層は約410 μl）。少量の上層（有機層）の混入は以降のステップに影響を与えない。
＊8 90℃、8分間保温すると20 μlの溶出液量は12～14 μlに減少する。多くの液量が必要な場合は、溶出液量を増やすとよい。また、90℃、8分間保温でDNAは変性し1本鎖になるため、クローニングなどの用途に使用する場合は、保温温度を80℃以下にする必要がある。例えば75℃で15分間保温にする。詳細は英文説明書参照のこと。


＜注意＞
使用時には、詳細は必ず添付の英文説明書をご確認ください。

＊1 は、製品コード 740980.10（10回用）の場合の調製法である。
製品コード 740980.50（50回用）,740980.250（250回用）の場合の調製法は英文説明書を参照すること。
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