AAVベクターの精製、濃縮
AAVpro Purification Kit Maxi (All Serotypes)（製品コード 6666）
5、6、7ではスイングローターを使用してください。
- AAVベクター抽出液の調製10.で得られた溶液に、Cryonase Cold-active Nucleaseを1/100量（終濃度200 U/ml）添加し、37℃で1時間反応させる。
- 1.の溶液にPrecipitator Aを1/10量添加し、ボルテックスで10秒間混和後、37℃で30分間反応させ、再度ボルテックスで10秒間混和する。
注1 Precipitator Aは低温保存により白色沈殿物が生じることがあるが、品質、性能には問題ない。
この場合は、37℃で温めて完全に溶解させてから使用する。
注2 反応中に沈殿物が生じることがあるが問題ない。そのまま次のステップに進む。 - 2.の溶液に1/20量のPrecipitator Bを添加し、速やかにボルテックスで10秒間混和し、5,000～9,000×g、4℃で5分間遠心する。
注 Precipitator B添加後に沈殿物が生じるが問題ない。そのまま遠心操作に進む。 - 上清をMillex-HV 0.45 μmを用いてろ過する。
- 4.でろ過したAAVベクター溶液をAmicon Ultra-15, 100 kDaに添加し、2,000×g、15℃で5分間遠心し、AAVベクター溶液が1.5 ml以下になったことを確認する。
注 AAVベクター溶液が1.5 ml以下になっていない場合は、5.の遠心操作を繰り返し実施する。 - ろ液を除去後、5 mlのSuspension Bufferをカップ内に添加し、ピペッティングで溶液を均一化し、2,000×g、15℃で5分間遠心する。AAVベクター溶液が1.5 ml以下になったことを確認する。
注 AAVベクター溶液が1.5 ml以下になっていない場合は、6.の遠心操作を繰り返し実施する。 - 6.の操作を4回（total 5回）繰り返し、最終的に任意の容量まで濃縮する。
- ろ液を除去後、ボルテックスで30秒間、もしくはピペッティングで十分に懸濁し、Amicon Ultra-15, 100 kDaカップ内のAAVベクター溶液をチューブに移す。
