RNA合成

IVT反応例

<例>CleanCap Reagent AG[あるいはCleanCap Reagent AG (3’ OMe)]を用いたmRNA合成反応

室温にて下記の各コンポーネントを記載順に加え、反応液を調製する。

コンポーネント 使用量
Nuclease-Free Water X μl
10× Transcription Buffer*1 2 μl
10× ATP*2 2 μl
10× CTP*2 2 μl
10× GTP*2 2 μl
10× UTP*2 2 μl
  CleanCap Reagent AG*3(100 mM) 1.6 μl
  鋳型DNA*4 1 μg
10× Enzyme Mix 2 μl
Total*5 20 μl


37℃ 2時間インキュベーション

DNase I処理 & LiCl沈殿精製

[IVT反応時の注意事項]

*1 10× Transcription Buffer中にはスペルミジンが含まれています。スペルミジンは核酸と複合体を形成して、場合によっては不溶物質として沈殿する可能性がありますので、必ず記載順にコンポーネントを加えてください。
*2 各NTP濃度は100 mMです。修飾NTPを使用する場合は、対応するNTPを等量で置き換えてください。
*3 CleanCap Reagent AG[あるいはCleanCap Reagent AG (3’ OMe)]は、NTPに対して4/5のモル比(最終濃度8 mM)でご使用ください。
*4 AGGの転写開始配列を有する鋳型(線状化DNA)をご使用ください。最適な鋳型量は用いる鋳型の大きさや種類によって異なりますが、通常0.5~2 μgの範囲でご使用ください。
*5 必要量に応じてスケールアップ可能です。10倍スケールの200 μl反応系とした場合でも、最終mRNA合成収量の直線性(収量の期待値)に問題がないことを確認済みです。