IVT反応例
＜例＞CleanCap Reagent AG[あるいはCleanCap Reagent AG (3’ OMe)]を用いたmRNA合成反応
室温にて下記の各コンポーネントを記載順に加え、反応液を調製する。
| コンポーネント | 使用量 |
| Nuclease-Free Water | X μl |
| 10× Transcription Buffer*1 | 2 μl |
| 10× ATP*2 | 2 μl |
| 10× CTP*2 | 2 μl |
| 10× GTP*2 | 2 μl |
| 10× UTP*2 | 2 μl |
| CleanCap Reagent AG*3（100 mM） | 1.6 μl |
| 鋳型DNA*4 | 1 μg |
| 10× Enzyme Mix | 2 μl |
| Total*5 | 20 μl |
↓
37℃ 2時間インキュベーション
↓
DNase I処理 & LiCl沈殿精製
[IVT反応時の注意事項]
| ＊1 | 10× Transcription Buffer中にはスペルミジンが含まれています。スペルミジンは核酸と複合体を形成して、場合によっては不溶物質として沈殿する可能性がありますので、必ず記載順にコンポーネントを加えてください。 |
| ＊2 | 各NTP濃度は100 mMです。修飾NTPを使用する場合は、対応するNTPを等量で置き換えてください。 |
| ＊3 | CleanCap Reagent AG[あるいはCleanCap Reagent AG (3’ OMe)]は、NTPに対して4/5のモル比（最終濃度8 mM）でご使用ください。 |
| ＊4 | AGGの転写開始配列を有する鋳型（線状化DNA）をご使用ください。最適な鋳型量は用いる鋳型の大きさや種類によって異なりますが、通常0.5～2 μgの範囲でご使用ください。 |
| ＊5 | 必要量に応じてスケールアップ可能です。10倍スケールの200 μl反応系とした場合でも、最終mRNA合成収量の直線性（収量の期待値）に問題がないことを確認済みです。 |
