BcaBEST® RNA PCR Kit Ver. 1.1
複雑な二次構造をもつターゲットの増幅
■ 方法
ターゲット:IGFR II遺伝子516 bp(GC含量63.5%)
サンプル:ヒト骨格筋由来全RNA 5 μg/RT液20 μl
逆転写反応液の調製
試薬 | 使用量 |
2×Bca1st Buffer | 10 μl |
MgSO4(25 mM) | 4 μl |
dNTP Mixture(10 mM) | 1 μl |
RNase Inhibitor | 0.5 μl |
BcaBEST Polymerase | 1 μl |
Oligo dT Primer | 1 μl |
サンプルRNA | 1 μl |
RNase Free dH2O | 1.5 μl |
Total | 20 μl |
逆転写反応条件
65℃ | 1 min | 1 cycle |
30℃ | 5 min |
↓ | 15 min |
65℃ | 15 min |
98℃ | 5 min |
5℃ | 5 min |
PCR反応
A法(通常の方法) |
試薬 | 使用量 |
MgSO4(25 mM) | 6 μl |
5×Bca 2nd Buffer | 16 μl |
Bca-Optimized Taq | 0.5 μl |
上流プライマー | 1 μl |
下流プライマー | 1 μl |
滅菌精製水 | 55.5 μl |
Total | 80 μl |
B法 |
試薬 | 使用量 |
MgSO4(25 mM) | 6 μl |
2×Bca1st Buffer | 16 μl |
Bca-Optimized Taq | 0.5 μl |
上流プライマー | 1 μl |
下流プライマー | 1 μl |
滅菌精製水 | 31.5 μl |
Total | 80 μl |
上記の反応液(80 μl)を逆転写反応終了液(20μl)に別々に加え、以下の条件でPCRを行った。
PCR反応条件
94℃ | 1 min | |
94℃ | 30 sec | 40 cycles |
60℃ | 30 sec |
72℃ | 1 min |
72℃ | 5 min | |
■ 結果
A法(通常の方法)では増幅産物が得られなかったが、B法では増幅産物が得られた。
レーン
M | :100 bp DNA Ladder |
1 | :BcaBEST RNA PCR Kit Ver. 1.1 A法 |
2 | :BcaBEST RNA PCR Kit Ver. 1.1 B法 |
3 | :TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver. 2.1 |
4 | :TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)Ver. 1.1 |
3% アガロースゲル
BcaBEST® RNA PCR Kit Ver. 1.1