BcaBEST™ RNA PCR Kit Ver. 1.1

複雑な二次構造をもつターゲットの増幅

■ 方法

ターゲット:IGFR II遺伝子516 bp(GC含量63.5%)
サンプル:ヒト骨格筋由来全RNA 5 μg/RT液20 μl

逆転写反応液の調製
試薬使用量
Bca1st Buffer10 μl
MgSO4(25 mM)4 μl
dNTP Mixture(10 mM)1 μl
RNase Inhibitor0.5 μl
BcaBEST Polymerase1 μl
Oligo dT Primer1 μl
サンプルRNA1 μl
RNase Free dH2O1.5 μl
Total20 μl
逆転写反応条件
65℃1 min1 cycle
30℃5 min
15 min
65℃15 min
98℃5 min
5℃5 min
PCR反応
A法(通常の方法)
試薬使用量
MgSO4(25 mM)6 μl
Bca 2nd Buffer16 μl
Bca-Optimized Taq0.5 μl
上流プライマー1 μl
下流プライマー1 μl
滅菌精製水55.5 μl
Total80 μl
B法
試薬使用量
MgSO4(25 mM)6 μl
Bca1st Buffer16 μl
Bca-Optimized Taq0.5 μl
上流プライマー1 μl
下流プライマー1 μl
滅菌精製水31.5 μl
Total80 μl

上記の反応液(80 μl)を逆転写反応終了液(20μl)に別々に加え、以下の条件でPCRを行った。

PCR反応条件
94℃1 min 
94℃30 sec40 cycles
60℃30 sec
72℃1 min
72℃5 min 

■ 結果

A法(通常の方法)では増幅産物が得られなかったが、B法では増幅産物が得られた。
電気泳動像
レーン
M:100 bp DNA Ladder
1BcaBEST RNA PCR Kit Ver. 1.1 A法
2BcaBEST RNA PCR Kit Ver. 1.1 B法
3:TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver. 2.1
4:TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)Ver. 1.1
3% アガロースゲル

  BcaBEST™ RNA PCR Kit Ver. 1.1