TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice®

TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(TP600) を用いたグラジエントPCR

3ステップまたは2ステップPCRによってλ DNAの8 kbp領域を増幅する場合の最適な温度(アニーリング、伸長)条件を、Diceのグラジエント機能を用いて検討した。

反応液組成

TaKaRa Ex Taq (5 units/μl)0.25 μl
10×Ex Taq buffer(Mg2+ plus)5 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μl
Primer 1 (20 μM)0.5 μl
Primer 2 (20 μM)0.5 μl
λ DNA (0.5 ng/μl)1 μl
滅菌蒸留水38.75 μl

Total volume50 μl

PCR条件

・ 2 step
98℃10 sec ┐30 cycles
52~72℃ 5 min ┘
(温度幅20℃でのグラジエント)


・ 3 step
98℃10 sec. ┐30 cycles
45~65℃30 sec. │
(温度幅20℃でのグラジエント)
72℃5 min. ┘

結果

・2 step PCR の結果
アニーリング/伸長 温度が高いほど、低分子の非特異的増幅が減少し、 目的の増幅産物量が増加した(図1)。


図1 2ステップPCRにおけるアニーリング/伸長 温度の検討
M : λ-Hind III digest
ヒートブロック(96穴)の1列目から12列目の間のグラジエント設定は、1列目を52℃、12列目を72℃に設定した(グラジエント温度幅は20℃)。


・3 step PCR の結果
アニーリング温度が高いほど、低分子の非特異的増幅が減少した(図2)。


図2 3ステップPCRにおけるアニーリング温度の検討
M : λ-Hind III digest
ヒートブロック(96穴)の1列目から12列目の間のグラジエント設定は、1列目を45℃、12列目を65℃に設定した(グラジエント温度幅は20℃)。

  TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice®