pSINsiベクターシリーズ

siRNA発現レトロウイルスによるノックダウン

GFPのターゲット配列(GGAGTTGTCCCAATTCTTG)に対するヘアピン型RNA発現のためのオリゴDNA(下記)を合成し、それをpSINsi-hH1、pSINsi-hU6、pSINsi-mU6のBamH I-Cla I部位に挿入し、siRNA発現用レトロウイルスベクタープラスミドを構築した。ネガティブコントロールとして、ターゲット配列に対するスクランブル配列(GTTACTTGAGCTCGTACGT)を用意した。

BamH I target sequence (sense) Hairpin loop target sequence (antisense) Terminator  Cla I
Top strand 5'-GATCC GGAGTTGTCCCAATTCTTG CTGTGAAGCCACAGATGGG CAAGAATTGGGACAACTCC TTTTTT AT-3'
Bottom strand 3'-G CCTCAACAGGGTTAAGAAC GACACTTCGGTGTCTACCC GTTCTTAACCCTGTTGAGG AAAAAA TAGC-5'

Retrovirus Packaging Kit Amphoを用いて293T細胞で一過性にアンフォトロピックウイルス産生を行い、NIH/3T3細胞で力価を測定した。
  力価(cfu/ml)
SINsi-hH1-GFP 1.3×106
SINsi-hH6-GFP 1.6×106
SINsi-mU6-GFP 0.7×106

GFPを安定に発現しているNIH/3T3細胞(マウス由来)およびHT1080細胞(ヒト由来)に、GFPに対するヘアピン型RNAを発現するレトロウイルスベクター(Ampho-SINsi-hH1-GFP、Ampho-SINsi-hU6-GFP、Ampho-SINsi-mU6-GFP)、およびネガティブコントロールベクター(Ampho-SINsi-hU6-Nc)をMOI = 0.1以下の条件でポリブレン法によって感染した。感染細胞はG418培地で二週間選択の後、GFPの蛍光強度をフローサイトメーターで測定し、GFP蛍光強度の低下を算出した(図)。siRNA発現レトロウイルスによるRNAi効果が確認された。
siRNA発現レトロウイルスによるGFPのノックダウン

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