pSINsiベクターシリーズ

インテグリンをノックダウンした細胞を用いたノーザンブロッティングによるRNAi効果の検出(400Jr)

pSINsi-hU6 DNA(製品コード 3661)

【方法】

(1)細胞の調製
pSINsi-hU6 DNA(製品コード 3661)を用いてインテグリンα5(NM_002205)に対するshRNA発現レトロウィルスベクターを構築し、RetroNectin(製品コード T100A)を用いて遺伝子導入を行い、インテグリンα5ノックダウンK-562細胞を獲得した(S5)。さらに、この細胞をPE標識抗インテグリンα5モノクローナル抗体で染色し、よりノックダウンされた細胞集団をソーティングにより取得した(S5L)。ネガティブコントロールとしてターゲット配列をランダムシャッフリングしたスクランブル配列のshRNA発現ベクターを導入した細胞を獲得した(N5)。


(2)ノーザンブロッティングによるRNAi効果の確認
約2×107個のK-562、S5、S5L、N5細胞からRNAiso(製品コード 9105)を用いてtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNA各30 μgを用いて電気泳動を行い、ナイロンフィルターに転写した。プローブは、インテグリンα5およびGAPDHのmRNA検出用のリアルタイムPCR用プライマーを用い、K-562細胞のtotalRNAを鋳型としてRT-PCR反応によりDIGラベルを行い調製した。DIGラベルしたプローブを先のフィルターに42℃・16時間の条件でハイブリダイズし、洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗DIG抗体と反応し、発光基質CDP-Star AP Substrate(製品コード 69086-3)を用いて発光反応後、検出を行った。

【結果】

S5、S5L細胞においてインテグリンがノックダウンされていることが確認されました(図1)。さらに、各細胞で発現しているインテグリンα5のmRNAシグナル強度をGAPDHのmRNAシグナル強度で補正し、インテグリンα5のmRNA量の相対値を数値化した(図2)。LuminoShot 400Jrを用いてmRNAを定量化したデータは、リアルタイムPCRを用いたmRNAの定量や、抗インテグリン抗体を用いたフローサイトメーターでの定量結果と相関があることがわかった。

図1 ノーザンブロッティングによるインテグリンの検出
  1: K-562、2: N5、3: S5、4: S5L
GAPDHインテグリンα5



図2 インテグリンα5・mRNA量の相対比較

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