PCR検査

EMAは死菌由来DNAを効率よく修飾するが、菌種や菌数、処理条件によっては生菌にも若干の影響を与えることが知られている。純培養した生菌を段階希釈して、本キットによるEMA処理あり／なしの結果を比較することにより、生菌への影響を確認する。

対象のグラム陰性菌について、EMA処理により、どの程度までの死菌量に対して死菌由来DNAからのPCR増幅を抑制できるかをあらかじめ確認しておくことが重要である。純培養した生菌から熱処理等により死菌を調製し、段階希釈して、本キットによるEMA処理あり／なしの結果を比較することにより、死菌抑制効果を確認する。
エンドポイントPCRの場合は、目的サイズのバンドの有無で完全に抑制可能な最大死菌量を確認し、その範囲内で実検体の測定を行う。（その範囲を超える死菌が存在する場合には、EMA処理により完全に抑制できない可能性がある。）死菌抑制効果が不十分な場合は、EMA処理回数を増やす、あるいはPCR増幅サイズを大きくするといった条件検討を行う。
リアルタイムPCRの場合には、完全に抑制可能な最大死菌量のEMA処理なしでのCt値（Xとする）を参考にすることで、検体サンプル中の死菌由来DNAが完全に処理されたかどうかを推測することも可能である。EMA処理なしサンプルのCt値（Y）がY ＞ X であれば、死菌由来DNAはほぼ修飾されたと推測できる。Y ≦ X の場合には、検体中の死菌量が多く、EMA処理により完全には修飾できなかった可能性を考慮する必要がある。

【検討例2】

方法：	実際に近い状況で確認するため、103～107個の生菌に一定数（105個）の死菌を混合したものを用意し、EMA処理あり／なしの結果を比較した。

結果：EMA処理後には、死菌由来の増幅が抑制され、生菌が初発数依存的に検出できた。