TaKaRa Ex Premier™ DNA Polymerase

In-Fusionクローニングキットと組み合わせた簡単・効率的なクローニング

TaKaRa Ex Premier DNA Polymerase（色素なしタイプ／色素ありタイプ）で増幅したPCR産物（平滑末端）と線状化プラスミドベクターを用いてIn-Fusion Snap Assembly Master Mixでクローニングを行い、目的クローンの取得効率を確認した。インサートとなるPCR産物の末端は線状化プラスミドベクターの末端15塩基と相同配列となるように設計している。なお、In-Fusion反応の際、Cloning Enhancerを使用し、PCR産物を精製せずに反応に用いた。

＜In-Fusionクローニングの流れ＞
In-Fusionクロージングの流れ

1) EX Premier（色素なしタイプ／色素ありタイプ）による各種ターゲット遺伝子の増幅
TaKaRa Ex Premier Dye plusマーカー

レーン	1:	PLN	（159 bp）
	2:	FABP3	（402 bp）
	3:	MYL2	（501 bp）
	4:	CITED2	（813 bp）
	5:	GATA4	（1,329 bp）
	6:	ADRB1	（1,434 bp）

レーン	7:	KCNQ1	（2,031 bp）
	8:	PKP2	（2,514 bp）
	9:	KCNH2	（3,480 bp）
	10:	MYH6	（5,820 bp）
	11:	RYR2	（14,904 bp）
	M1:	100 bp DNA Ladder
	M2:	λ-Hind III digest

TaKaRa Ex PremierのPCR条件：

94℃	1	min.
98℃	10	sec.	30 cycles
68℃	30	sec./kb	30 cycles

11種類のターゲット遺伝子をTaKaRa Ex Premier DNA Polymeraseを用いて増幅し、電気泳動で確認したところ、ほぼ全ての遺伝子において、非特異的増幅がなく目的バンドのみで正確に増幅されていることが明らかとなったため、Cloning Enhancerでの前処理を行った。Cloning Enhancerを使えば、PCR産物の精製が不要で簡単かつ安心してIn-Fusion反応を行うことができる。

2) EX Premier（色素なしタイプ／色素ありタイプ）で増幅したPCRアンプリコンでのクローニング結果
Ex Premier で増幅したPCR アンプリコンでのクローニング結果

1)で増幅したターゲット遺伝子のうち、PLNとGATA4由来のアンプリコンを使用してIn-Fusionクローニングを行い、得られた大腸菌コロニーを5個ランダムに選択し、インサートチェックを実施した。色素なしタイプ／色素ありタイプに関わらず、全てにおいて目的インサートを確認することができた。

TaKaRa Ex Premier™ DNA Polymerase