Recombinant RNase Inhibitor ver.2.0

■ プロトコール（酸化耐性評価試験）

1. 各種RNase Inhibitorの保存溶液をDTT-free溶液に置換・濃度調製（25 U/μl）
2. 反応基質溶液の調製: 10 μgの16S/23S rRNAを反応溶液で希釈（total volume = 95 μl）
3. 反応基質溶液に 2 μlのoxidation buffer（H₂O₂含有溶液）を添加
4. 50 U (2 μl) の RNase Inhibitor（DTT-free, 25 U/μl）を添加し、37℃で30分間インキュベーション
5. 1 μlのRNase A（0.075 mg/ml）を添加し、37℃で10分間インキュベーション
6. 25℃で10分間インキュベーション（in water bath）
7. 50 μlの反応停止液を添加
8. 氷上で15分間インキュベーション
9. 12,000 rpm、4℃で15分間遠心
10. 上清に遊離する核酸量を測定

図1. 酸化耐性能の比較試験結果
酸化耐性能を強化したRecombinant RNase Inhibitor ver.2.0（製品コード 2315A）、従来品のRecombinant RNase Inhibitor（製品コード 2313A）および他社酸化耐性RNase Inhibitorの3製品について、過酸化水素H₂O₂を用いて酸化耐性能を評価した（3重測定×2回の試験）。 H₂O₂濃度の低い領域では大きな差は認められないが、 H₂O₂濃度が0.01％を超えるあたりからRNase Aによる基質（16S/23S rRNA）の分解・遊離に差が生じており、不活化の原因となりやすいシステイン残基に変異を導入したRecombinant RNase Inhibitor ver.2.0（製品コード 2315A）が最も強い酸化耐性を有していることが示された。