5’-RACEと3’-RACEによりcDNAを取得
- 同一サンプルから5’-RACEと3’-RACEの両方を実施
- ライブラリースクリーニング不要で、1週間以内にcDNAを取得
- 面倒な一本鎖ライゲーション反応やテール形成反応が不要
Marathon cDNA Amplification Kitは、特別に設計したアダプターを利用してバックグラウンドを大幅に低下させ、同じ鋳型で5’-RACEと3’-RACEの両反応を可能にする方法である（1、2）。Marathon cDNA増幅法を用いると、 EST（expressed sequenced tag）、ディファレンシャルディスプレイ、RNAフィンガープリントまたはcDNAサブトラクションで特定した各種RNAを速やかに検討することができる。
Marathon cDNA合成法では、まず最初に3’末端に2残基の縮重ヌクレオチドを含む改変型ロックドック（lock-docking）オリゴ（dT）プライマーとpoly A+ RNAを使用する。この縮重ヌクレオチドによってpoly A+テール開始部位にプライマーが結合するため、従来のオリゴ（dT）プライマー法のような3’側の不均一性が避けられる。cDNA合成後に平滑末端を形成させ、二本鎖cDNAの両端にMarathon Adaptorをライゲートする。
Marathon cDNA Amplification Kitには、cDNA合成5回分の試薬類、PCR100回分のPCRプライマーの他に、お試しサイズのNucleoTrap Gel Extraction Kitが試供品として同梱されている。
ClontechではMarathon-Ready cDNAも用意している。これは高品質なPremium Poly A+ RNAから作製した二本鎖cDNAであり、Marathon Adaptorがあらかじめ連結されている。これらのcDNAはそのまま5’-RACEと3’-RACE PCRに使用可能であり、種々の組織や細胞に由来する製品が利用できる。
※本キットにはPCR酵素が含まれないので、別途用意する。Clontechでは、Advantage 2 Polymerase Mixの使用を推奨している。
図1. Marathon cDNA法による、存在量の多い転写産物（アクチン、1.9 kb）および中程度に稀少な転写産物（TFR、5.1 kb）の増幅
ヒト胎盤poly A+ RNA 1 μgを材料にds cDNAを調製してアダプターをライゲートし、アクチンおよびTFRについて5’-と3’-の両RACE反応を行った。PCRは25サイクルで行った。ユーザーマニュアルに記載の方法で、両末端を含む全長cDNAがend-to-end に増幅された。
レーン1：1.2 kbアクチン5’-RACE産物
レーン2：1.3 kbアクチン3’-RACE産物
レーン3：全長1.9 kbアクチンcDNA
レーン4：2.6 kb TFR 5’-RACE産物
レーン5：2.9 kb TFR 3’-RACE産物
レーン6：全長5.1 kb TFR cDNA
レーンM：1 kb DNAラダー
Marathon cDNA合成法では、まず最初に3’末端に2残基の縮重ヌクレオチドを含む改変型ロックドック（lock-docking）オリゴ（dT）プライマーとpoly A+ RNAを使用する。この縮重ヌクレオチドによってpoly A+テール開始部位にプライマーが結合するため、従来のオリゴ（dT）プライマー法のような3’側の不均一性が避けられる。cDNA合成後に平滑末端を形成させ、二本鎖cDNAの両端にMarathon Adaptorをライゲートする。
Marathon cDNA Amplification Kitには、cDNA合成5回分の試薬類、PCR100回分のPCRプライマーの他に、お試しサイズのNucleoTrap Gel Extraction Kitが試供品として同梱されている。
ClontechではMarathon-Ready cDNAも用意している。これは高品質なPremium Poly A+ RNAから作製した二本鎖cDNAであり、Marathon Adaptorがあらかじめ連結されている。これらのcDNAはそのまま5’-RACEと3’-RACE PCRに使用可能であり、種々の組織や細胞に由来する製品が利用できる。
※本キットにはPCR酵素が含まれないので、別途用意する。Clontechでは、Advantage 2 Polymerase Mixの使用を推奨している。
図1. Marathon cDNA法による、存在量の多い転写産物（アクチン、1.9 kb）および中程度に稀少な転写産物（TFR、5.1 kb）の増幅
ヒト胎盤poly A+ RNA 1 μgを材料にds cDNAを調製してアダプターをライゲートし、アクチンおよびTFRについて5’-と3’-の両RACE反応を行った。PCRは25サイクルで行った。ユーザーマニュアルに記載の方法で、両末端を含む全長cDNAがend-to-end に増幅された。
レーン1：1.2 kbアクチン5’-RACE産物
レーン2：1.3 kbアクチン3’-RACE産物
レーン3：全長1.9 kbアクチンcDNA
レーン4：2.6 kb TFR 5’-RACE産物
レーン5：2.9 kb TFR 3’-RACE産物
レーン6：全長5.1 kb TFR cDNA
レーンM：1 kb DNAラダー
内容
・Marathon cDNA Adaptor
・cDNA Synthesis Primer
・AMV Reverse Transcriptase
・First-Strand Reaction Buffer
・Second-Strand Enzyme Cocktail
・Second-Strand Buffer
・T4 DNA Polymerase
・T4 DNA Ligase
・DNA Ligation Buffer
・Adaptor Primer 1 (AP1)
・Nested Adaptor Primer 2 (AP2)
・dNTP Mix
・Control 5' & 3'-RACE TFR Primers
・Control Human Placenta Poly A+ RNA
・Positive Control cDNA
・Tricine-EDTA Buffer
・EDTA/Glycogen Mix
・Ammonium Acetate
・Sterile Deionized H2O
・NucleoTrap Gel Extraction Kit
注：Marathon cDNA Amplification Kitには、PCR用の耐熱性DNAポリメラーゼは含まれていません。なお、ClontechではAdvantage 2 DNA Polymerase Mixのご使用をお勧めしています。
・cDNA Synthesis Primer
・AMV Reverse Transcriptase
・First-Strand Reaction Buffer
・Second-Strand Enzyme Cocktail
・Second-Strand Buffer
・T4 DNA Polymerase
・T4 DNA Ligase
・DNA Ligation Buffer
・Adaptor Primer 1 (AP1)
・Nested Adaptor Primer 2 (AP2)
・dNTP Mix
・Control 5' & 3'-RACE TFR Primers
・Control Human Placenta Poly A+ RNA
・Positive Control cDNA
・Tricine-EDTA Buffer
・EDTA/Glycogen Mix
・Ammonium Acetate
・Sterile Deionized H2O
・NucleoTrap Gel Extraction Kit
注：Marathon cDNA Amplification Kitには、PCR用の耐熱性DNAポリメラーゼは含まれていません。なお、ClontechではAdvantage 2 DNA Polymerase Mixのご使用をお勧めしています。
保存
Control Human Placenta Poly A+ RNA：－70℃
NucleoTrap Gel Extraction Kit：室温
その他のコンポーネント：－20℃
NucleoTrap Gel Extraction Kit：室温
その他のコンポーネント：－20℃
- 注意事項
- 本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
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