pKF3 Cloning Test

制限酵素の高品質保証
pKF3 Cloning Test

制限酵素Quality Control

pKF3 Cloning TestはEnforcement Cloning Vector pKF3 DNAのマルチクローニングサイトに1ヵ所切断部位を持つ制限酵素についてテストしている。このDNAのマルチクローニングサイトはその全塩基配列が,rpsL遺伝子をコードしており、rpsL遺伝子が発現すると、宿主をストレプトマイシン（Sm）耐性からSm感受性に強制する。制限酵素にエキソヌクレアーゼ等の微量のヌクレアーゼが混在すると、rpsL遺伝子にデレーションが生じて、宿主はSm耐性のままとなる。この性質を利用することにより、制限酵素中に混在する微量のヌクレアーゼを検出することができる。

図1 pKF3 Cloning Testの原理図

pKF3 Cloning Testの操作方法

  1. Enforcement Cloning Vector pKF3マルチクローニングサイトに1ヵ所切断部位を持つ制限酵素について、pKF3DNAに対し10倍過剰の制限酵素を作用させる。
  2. 失活処理の後、切断されたDNAの一部をDNA Ligation Kit Ver.1（製品コード 6021）を用いて16℃で30分間反応させる。　
  3. この反応液の一部でTH2 Competent Cellsを形質転換し、LB-Cm-Sm plate（クロラムフェニコール、ストレプトマイシンを含む）、LB-Cm plate（クロラムフェニコールを含む）の2種類のプレート上で37℃で二晩培養する。
    制限酵素にエキソヌクレアーゼ等がほとんど含まれなければ、得られた形質転換体はストレプトマイシン感受性に強制されるので、LB-Cm-Sm plate上にはコロニーを形成しない。また、制限酵素にエキソヌクレアーゼ等がコンタミしていれば、rpsL遺伝子欠失株が得られるので、LB-Cm-Sm plate上にコロニーを形成する。LB-Cm-Sm plate上に出現するコロニーの有無により、極微量のエキソヌクレアーゼ等の有無を判定できる。TaKaRaでは形質転換体（LB-Cm plate上に出現するコロニー数）に対するrpsL遺伝子欠失形質転換体（LB-Cm-Sm plate上に出現するコロニー数）の占める割合が2％未満になることを確認している。

培地組成

LB-Cm-Sm plate
Yeast Extract5 mg/ml
Pepton10 mg/ml
NaCl5 mg/ml
Chloramphenicol30 μg/ml
Streptomycin50 μg/ml
Agar1.5%
LB-Cm plate
Yeast Extract5 mg/ml
Pepton10 mg/ml
NaCl5 mg/ml
Chloramphenicol30 μg/ml
Agar1.5%
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