AAVpro^® CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2)

AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free Systemは、CRISPR/Cas9ゲノム編集に使用するsingle guide RNA(sgRNA)とSaCas9遺伝子を発現するAAV2ウイルス粒子をヘルパーウイルス不要で作製するシステムである。本製品は、Staphylococcus aureus由来のSaCas9を使用した、ワンベクタータイプのアデノ随伴ウイルスCRISPR/Cas9システムであり、クローニングしたsgRNAとSaCas9ヌクレアーゼを同時に発現できる。
Staphylococcus aureus由来のSaCas9は、遺伝子サイズが3.3 kbと、従来から使用されているStreptococcus pyogenes由来のSpCas9（4.1 kb）より約1 kb短い。このため、1つのAAVの中にSaCas9遺伝子とsgRNAを入れることが可能となり、in vitroおよびin vivoでさまざまな細胞に対するゲノム編集を高効率で可能にした。ただし、SaCas9は、SpCas9とはPAM配列（Proto-spacer Adjacent Motif sequence）が異なっており、さらに標的配列の長さは20～22塩基が適当とされているため、sgRNAの設計において、注意が必要である（図2）。

本製品には、SaCas9/sgRNA発現AAVウイルスプラスミド構築に必要な試薬（10回分）、および組換えAAV2粒子作製に必要なpRC2-mi342 VectorとpHelper Vectorが含まれており、これらプラスミドを共にHEK293T細胞へ導入することにより、ヘルパーウイルスを使用せずに、高タイター組換えAAV2ウイルス粒子を調製できる。 ヒトU6プロモーターにより発現するsgRNAは、線状化pAAV-Guide-it-1に1ステップで直接クローニングが可能である。クローニングのための、高効率Ligation Mixと高効率コンピテント細胞Stellar Competent Cellsが含まれており、sgRNAに対応して設計されたオリゴDNAをアニーリング後、簡単に効率良くベクターにライゲーションし、形質転換することができる。またAAV粒子調製用ウイルス抽出溶液も含まれている。

図1. pAAV-Guide-it-1によるSaCas9とsgRNAの同時発現
pAAV-Guide-it-1のSaCas9とsgRNAの配列図。pAAV-Guide-it-1をパッケージングしたAAVを、標的細胞にトランスダクションすることでSaCas9とsgRNAを共発現する。


図2. SaCas9のPAM配列
SaCas9はPAM配列としてNNGRR(T)を認識し、その3 塩基上流を切断する（Nはどの塩基でもよく、RはAまたはG。
(T)はできるだけ考慮することを推奨する）。また標的配列としては20～22塩基が推奨されており、
SaCas9のsgRNAの設計は、http://benchling.comから可能である。


図3. AAVを用いたSaCas9とSpCas9のゲノム編集効率の比較
CYP2遺伝子Exon1の2ヵ所の配列を標的として2ベクタータイプのAAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free System (SpCas9)（製品コード 632608）と1ベクタータイプの AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free SystemのsgRNAをそれぞれ設計し、AAVウイルスを作製した。12ウェルプレートに1×10⁵個の細胞を播種し、一晩培養後、SpCas9またはSaCas9のウイルスベクターをそれぞれ1×10⁵ MOI（ベクターゲノム定量法）で感染させた。72時間後に細胞を回収し、ゲノムDNAへの変異導入効率（Indel％）をGuide-it Mutation Detection Kit（製品コード 631448）を用いて比較した（アガロースゲル電気泳動後、デンシトメーターで変異導入の割合を測定）。

AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2)（製品コード 632619）

1．	pAAV-Guide-it-1 Vector (Linear) （7.5 ng/μl）	20 μl
2．	Guide-it Ligation Components v3
	DNA Ligation Mighty Mix	50 μl
	Guide-it Oligo Annealing Buffer	1.5 ml
	Guide-it Control Annealed Oligos v3 (100 fmol/μl)	10 μl
	Guide-it Sequencing Primer 1 (100 pmol/μl)	10 μl
	PCR Grade Water	1 ml
3．	Stellar Competent Cells（製品コード 636763）
4．	pRC2-mi342 Vector（1 μg/μl）＊	20 μl
5．	pHelper Vector（1 μg/μl）＊	20 μl
6．	AAVpro Extraction Solution
	AAV Extraction Solution A	1.5 ml×3本
	AAV Extraction Solution B	150 μl×3本

AAVpro CRISPR/SaCas9 Vector System（製品コード 632618）

1．	pAAV-Guide-it-1 Vector (Linear) （7.5 ng/μl）	20 μl
2．	Guide-it Ligation Components v3
	DNA Ligation Mighty Mix	50 μl
	Guide-it Oligo Annealing Buffer	1.5 ml
	Guide-it Control Annealed Oligos v3 (100 fmol/μl)	10 μl
	Guide-it Sequencing Primer 1 (100 pmol/μl)	10 μl
	PCR Grade Water	1 ml
3．	Stellar Competent Cells（製品コード 636763）

＊ pRC2-mi342 Vector、およびpHelper Vectorは、事前にプラスミドDNAを増幅してご使用ください。

Stellar Competent Cells：－80℃
その他：－20℃
（AAVpro Extraction Solutionは溶解後、室温保存）