分泌型SEAPレポーターアッセイ

Great EscAPe SEAPレポーターアッセイは、Clontech独自のヒト胎盤由来分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）を用いる細胞溶解不要のレポーターアッセイである。シス作用性DNA配列およびトランス作用性因子の簡便かつ高感度な解析が可能である。生細胞アッセイであり、培養上清をサンプリングしてSEAP活性の経時的な比較や異なる条件下での比較が簡単に行え、引き続きウェスタンブロットやノザンブロットなどの下流の分析に細胞を用いることもできる。

Great EscAPe SEAP Chemiluminescence Kit 2.0は、従来のキットよりも高い感度とシグナル安定性を示す。新しい化学発光基質の採用でバックグラウンドのシグナルが大幅に低下し、ダイナミックレンジが拡大するため、高感度アッセイが可能となった（図1）。また、シグナルは従来のキットと比較して長時間高い安定性を示す（図1）。
測定するSEAP活性は目的のプロモーターに高い特異性を示す。例えば、本キットでCREプロモーターエレメントを分析すると、プロモーター特異的な誘導物質の添加7時間後にはSEAPシグナル強度の20倍の上昇が認められた（図2）。このSEAPアッセイの結果は4オーダーの酵素濃度範囲で直線性を示した（データは省略）。
また、従来のキットではバッファーを3種類使用していたが、2.0キットでは1種類のみを使用することでインキュベーションステップが短縮された。さらに、シグナル安定性の改善により結果判定が可能な時間が長くなったため、一日のワークフローに柔軟に組み入れることができるようになった。


図1. Great EscAPe SEAP Chemiluminescence Kit 2.0は従来のキットと比較して高感度でシグナルも安定
構成的CMVプロモーターの制御下にあるSEAP遺伝子を搭載したベクター、またはmockDNAで、HEK 293細胞を一過性に形質転換した。48時間後に培養液上清を回収し、従来のキットおよび2.0キットを用いてそれぞれのプロトコールでアッセイを行い、Turner BioSystems Modulus Microplate Multimode Readerで測定した。


図2. 高度に特異的なSEAP活性により20倍超の発現上昇
CREを含むプロモーター制御下でSEAPを誘導発現するベクター、またはmockDNAで、HEK 293細胞を一過性に形質転換した。形質転換から12時間後の細胞を、10 μMフォルスコリン添加培地または非添加の培地と交換し、7時間インキュベートした。フォルスコリンはCREを活性化し、サイトゾル内のcAMPレベルを上昇させてSEAPの発現を誘発する。培養液上清を回収し、新しいキットを用いてアッセイを行い、BD Monolight 3096 Luminometerで測定した。

SEAPの発現は、蛍光基質4-メチルウンベリフェリルリン酸（MUP）を用いた蛍光検出系で測定することもできる。わずか10^-13gのSEAPタンパク質でも検出可能な化学発光アッセイと比べると、蛍光アッセイの感度は劣るが、ホタル・ルシフェラーゼアッセイと同等な検出機能を有しており、最も高感度を要求する実験以外では全く問題はない。化学発光アッセイ、蛍光アッセイはともに4オーダーの酵素濃度範囲にわたって直線性を示す。

Great EscAPe SEAP Chemiluminescence Kit 2.0
（製品コード 631736、631737、631738）
・5× Dilution Buffer
・SEAP Substrate Solution
・Positive Control Placental AP

Great EscAPe SEAP Fluorescence Detection Kit
（製品コード 631704）
・MUP Fluorescent Substrate
・Assay & Dilution Buffers
・Positive Control Placental Alkaline Phosphatase

#631715、631717、631736、631737、631738：－20℃
#631704
　Alkaline Phosphatase：－20℃
　MUP Fluorescent Substrate、Assay Buffer、5× Dilution Buffer：4℃（暗所）