SMARTer^® Stranded RNA-Seq Kit

SMARTer Stranded RNA-Seq Kitはイルミナ社シーケンサー用RNA-seqライブラリー作製キットである。本キットはわずか100 pg～100 ngのRNAを用いてライブラリーの作製が可能であり、作製されたライブラリーはmRNA鎖情報を99%以上の正確性で保持しているため、Strand-Specific RNA-seqに使用できる。本キットは逆転写反応にランダムプライマーを利用するため、真核生物および原核生物由来のRNAに対応可能である。RNAは、poly (A)^＋ RNAまたはrRNA除去済total RNAを使用する。本キットはSMARTテクノロジーの改良により、コード領域RNA及び非コード領域RNA由来の転写産物を網羅したライブラリーを作製できる。また、未反応のindexやadaptorは作業工程において除去される。本キットにより、イルミナ社シーケンサー用のRNA-seqライブラリーを4時間以内に作製することができる。
SMARTer Stranded RNA-Seq Kit HTは、8種類のForward Primerと12種類のReverse Primerを含んでおり、最大96インデックスが設定できるハイスループット解析向けのキットである。
これらキットはNGSに適したPCR酵素SeqAmp DNA Polymeraseを含んでいる。
また、本キットにはインデックスプライマーが含まれているが、インデックスホッピング低減のためのユニークデュアルインデックスキット（別売）も使用可能である。

図1．SMARTer Stranded RNA-Seq KitはRNA 100 ngまたは100 pgを用いた繰返し実験において再現性の高いデータが得られた。



図2．RNA量に1,000倍差のあるサンプル間の比較においても、高い再現性と同様の感度が示された。
ヒト脳poly(A)^＋ RNA 100 ngおよび100 pgから作製したcDNAライブラリーの発現解析結果（FPKM）を示す。



図3．12種類のインデックスを用いたcDNAライブラリーのイルミナ社 HiSeqシーケンサーによる解析
ゲノムDNAの各strandから転写されたリードは正確に区別されるため、転写産物の発現定量や正確なアノテーションが可能である。RNA-Seq リードの99%は特定のDNA鎖へ正確にマッピングされた。


表1．RNA量 100 pgを用いたテスト

正確に転写されたDNA鎖を特定することができ、また約15,000種類の遺伝子を検出することが可能であった。



図4．ERCC解析での高い再現性
事前に取得した複数のERCCデータセットの相対的転写産物量に本キットにより得られたFPKMをマップした。92個のERCCセットがスロープ＝0.934、R2＝0.9725でマップされた。



図5．作製cDNAライブラリーの生成量および純度
ヒトpoly(A)^＋ RNA 100 ng～100 pgから作製されたcDNAライブラリーの生成量、純度をアジレント2100バイオアナライザーを用いて分析した。cDNAの増幅に使用したサイクル数も示す。cDNAライブラリーはSeqAmp DNA Polymerase（本キットに含まれる）により増幅した。

SMARTer Stranded RNA-Seq Kit（製品コード 634838～634839）は以下の3種類のセット品である。

• SMARTer Stranded RNA-Seq Kit
  
  Box 1：
  SMARTer Stranded Oligonucleotide
  Control Mouse Liver Total RNA
  
  Box 2：
  SMART Stranded N6 Primer
  5X First-Strand Buffer (RNase-Free)
  dNTP Mix（dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 各10 mM）
  Dithiothreitol（DTT）
  SMARTScribe Reverse Transcriptase
  Nuclease-Free Water
  RNase Inhibitor
  Stranded Elution Buffer
• Illumina Indexing Primer Set（各12.5 μM）
  
  Universal Forward PCR Primer
  Reverse PCR Primer Index 1
  Reverse PCR Primer Index 2
  Reverse PCR Primer Index 3
  Reverse PCR Primer Index 4
  Reverse PCR Primer Index 5
  Reverse PCR Primer Index 6
  Reverse PCR Primer Index 7
  Reverse PCR Primer Index 8
  Reverse PCR Primer Index 9
  Reverse PCR Primer Index 10
  Reverse PCR Primer Index 11
  Reverse PCR Primer Index 12
• SeqAmp DNA Polymerase
  
  SeqAmp DNA Polymerase
  SeqAmp PCR Buffer（2X）

SMARTer Stranded Oligonucleotide、Control Mouse Liver Total RNA： －70℃
Stranded Elution Buffer ：－20℃、溶解後は室温で保存可能
その他の試薬： －20℃

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

・シングルチャンネルピペット: 10 μl、20 μlおよび200 μl
・フィルターピペットチップ: 10 μl、20 μlおよび200 μl

PCR 増幅
・PCR サーマルサイクラー
・High Sensitivity DNA Kit （Agilent社 Code. 5067-4626）
・Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml ; USA Scientific社 Code. 1402-4700）
・Nuclease-free nonsticky 1.5-ml tube（USA Scientific社 Code. 1415-2600）

SPRI Bead精製
・Agencourt AMPure PCR Purification Kit（5 ml; Beckman Coulter社 Code. A63880、60 ml ; Beckman Coulter社 Code. A63881）
・MagnaBot II Magnetic Separation Device（プロメガ社 Code. V8351）
・80％ Ethanol

リボソームRNAの除去：
本製品を用いたcDNA合成の前に、リボソームRNAを除去することを強くお勧めします。
リボソームRNAの除去にはRiboGone-Mammalianをお使いください。