SMART-Seq® Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR™ Mammalian)

UMI付き、微量total RNA(250 pg~10 ng)から方向性情報を持ったNGS用ライブラリー調製が可能
  • ヒト、マウス、ラットの微量(250 pg~10 ng)のtotal RNA、または10~1,000個の細胞からRNA-Seq解析が可能
  • UMI(分子バーコード)により、PCR増幅バイアスの影響とシーケンスエラーが軽減され、より正確なNGS解析が可能
  • FFPEやLCM由来の分解を受けたRNAやcell-free RNAを含むすべての品質のRNAから信頼性の高い結果を取得
  • バッファーの改良により、6.5時間で方向性情報を保持したRNA-Seqライブラリーを調製可能
  • rRNA除去試薬の改良により、効果的にrRNAのリードを除去
  • Unique Dual Index Kit(製品コード 634752~634756)と組み合わせることにより、最大384サンプルのマルチプレックス解析に対応可能
注:SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian)は、SMARTer Stranded Total RNA - Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian(製品コード 634485~634488)のリニューアル製品で、rRNA除去試薬の性能が向上しています(図8参照)。既存製品とは異なりインデックスが別売りとなっていますので、必ず別途ご購入ください。(Unique Dual Index Kit参照

新製品と既存製品の対応表はこちら(TB USA社のサイト)
製品コード メーカー
略称
製品名 容量 価格(税別) 特記事項 説明書、CoA
データシート
ベクター情報
参考資料 カート
Takara Code
634354

CLN

Clontech
SMART-Seq® Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR™ Mammalian)
NEW 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法) 安全データシート(SDS)添付 ライセンス
24回 ¥380,000
30%OFFモニターキャンペーン実施中!
説明書・データシート・ベクター情報
Z4354N
634355

CLN

Clontech
SMART-Seq® Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR™ Mammalian)
NEW 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法) 安全データシート(SDS)添付 ライセンス
96回 ¥1,050,000
説明書・データシート・ベクター情報
Z4355N
634356

CLN

Clontech
SMART-Seq® Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR™ Mammalian)
NEW 化学物質排出把握管理促進法(PRTR法) 安全データシート(SDS)添付 ライセンス
96回×4 ¥3,500,000
説明書・データシート・ベクター情報
Z4356N
634756

CLN

Clontech
Unique Dual Index Kit (1-24)
24回 ¥38,000
説明書・データシート・ベクター情報
Z4756N
634752

CLN

Clontech
Unique Dual Index Kit (1-96)
96回 ¥96,000
説明書・データシート・ベクター情報
Z4752N
634753

CLN

Clontech
Unique Dual Index Kit (97-192)
96回 ¥96,000
説明書・データシート・ベクター情報
Z4753N
634754

CLN

Clontech
Unique Dual Index Kit (193-288)
96回 ¥96,000
説明書・データシート・ベクター情報
Z4754N
634755

CLN

Clontech
Unique Dual Index Kit (289-384)
96回 ¥96,000
説明書・データシート・ベクター情報
Z4755N
本キットにはIndexが含まれていません。Unique Dual Index Kit(製品コード 634752/634753/634754/634755/634756)を別途ご購入ください。
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製品説明

SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian) は、250 pg~10 ngのヒト、マウス、ラットのtotal RNAまたは10~1,000個のインタクトな細胞から、イルミナ社次世代シーケンサー対応のライブラリーを調製するキットです。高品質のRNAはもちろん、FFPEやLCMサンプルから調製された分解の進んだ低品質RNAも使用することができます(* 低品質RNAの場合は500 pg~10 ng)。本キットは、SMART(Switching Mechanism at 5' End of RNA Template)テクノロジーを用いており、逆転写およびPCR増幅ステップでインデックスとアダプターを組み込むシームレスなワークフローにより、Strand情報を保持したライブラリーを調製できます。更に、逆転写ステップで8塩基の個別の分子バーコード(Unique Molecular Identifier:UMI)も付加されるため、PCR増幅バイアスによる影響とシーケンスエラーが軽減され、より正確で信頼性の高いNGS解析が可能となります。
本キットのワークフローにはrRNA特異的プローブを使用した独自技術によってrRNA(および一部ミトコンドリアRNA)由来のcDNAを除去する工程が含まれているため、別途リボゾームRNA除去試薬を用意する必要はなく、rRNAへのマッピングが低い再現性の高いデータが得られます。
ライブラリー調製、精製を含む全ての操作は6.5時間で終了し、別売りのUnique Dual Index Kit(製品コード 634752~634756)と組み合わせることにより、最大384サンプルのマルチプレックス解析に対応可能です。
図1. 実験フローチャート

図2. SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian) を用いて調製された最終ライブラリーの構造
Unique Dual Index Kit(製品コード 634752~634756)を用いて付加された配列には、イルミナ社シーケンサーのフローセルでクラスタリングできる配列(P7、P5、Index 1 [i7]、Index 2 [i5])と、シーケンスプライマーRead 2およびRead 1を認識する領域が含まれている。Read 1では元のRNAのアンチセンス側の配列が得られ、Read 2では元のRNAのセンス側の配列が得られる。Read 2の最初の8塩基はUMIで、その下流にUMIリンカー3塩基(NNN)とSMART UMI Adapter由来の3塩基(XXX)が続く。paired-end sequencingを行った場合、SMART UMI Adapter由来の3塩基(XXX)をマッピングの前にトリミングする必要がある。

図3. 異なるRNAインプット量から調製したライブラリーのrRNA由来cDNA除去効果と遺伝子数、トランスクリプト数の評価
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIsを用いて、250 pgおよび10 ngのヒト脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理(ZapR treatment)を実施したものと実施しないもので比較した。ZapR treatmentしたものはPCR増幅による濃縮後、ZapR treatmentしないものはそのままシーケンスに使用した。それぞれのライブラリーについて3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、その結果を棒グラフ(パネルA)と表(パネルB)に示した。
250 pg 、10 ngのいずれのインプット量でも、ZapR treatmentしたライブラリーのrRNA readsの割合は10%以下となっており、幅広いレンジでrRNA由来cDNAが効率よく除去されることが示された。また、ZapR treatmentしたライブラリーでは、遺伝子数、トランスクリプト数が増加した。

図4. インプット量の異なるサンプル間での相関性
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian) を用いてヒト脳total RNA 250 pgおよび10 ngからRNA-Seqライブラリーを調製し、それぞれのライブラリーについて、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析して相関性を調べた。その結果、インプット量250 pgと10 ngの間で高い相関性が得られた。

図5. ヒト初代B細胞から調製したtotal RNA-Seqライブラリーの遺伝子数とトランスクリプト数
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIsを用いて、ヒト初代B細胞のtotal RNA 1 ngからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理(ZapR treatment)を実施したものと実施しないもので比較した。ZapR treatmentしたものはPCR増幅による濃縮後、ZapR treatmentしないものはそのままシーケンスに使用した。それぞれのライブラリーについて、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、その結果を棒グラフ(パネルA)と表(パネルB)に示した。
その結果、ZapR treatmentしたライブラリーのrRNA readsの割合は10%以下となっており、rRNA由来cDNAが効率よく除去されることが示された。また、ZapR treatmentしたライブラリーでは、遺伝子数、トランスクリプト数が増加した。

図6. ヒト初代B細胞から調製したライブラリーのレプリケート間での比較
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian) を用いて、1 ngのヒト初代B細胞のtotal RNAからduplicateでライブラリーを調製し、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析して相関性を調べた。その結果、レプリケート間で高い相関性が示された。

図7. 分解を受けたFFPE RNAサンプルから調製されたライブラリーの評価
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian) を用いて、10 ngのFFPE RNA(RIN=3、DV200=77%)からduplicateでライブラリーを調製し、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、その結果を棒グラフ(パネルA)と表(パネルB)に示した。その結果、分解を受けたサンプルからでもレプリケート間で高い再現性が示された。

図8. rRNA除去試薬の新/既存製品比較
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs(新製品)を用いて、250 ngのヒト脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理(ZapR treatment)を実施し、PCR増幅により濃縮した。コントロールとしてZapR treatmentしていないライブラリーをそのまま用いた(No depletion)。更に、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian(既存製品)を用いて、250 ngのヒト脳RNAからライブラリーを調製した。
それぞれのライブラリーについて、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、リード分布を比較した。
ZapR Mammalian rRNA Depletion Kitで処理したライブラリーのリード分布は、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalianで調製したライブラリーと比較したところ、rRNAのリードの割合が減少してExonのリードの割合が増加し、rRNA除去試薬の性能向上が示された。

図9. マウス脳total RNA-Seq ライブラリーのrRNA除去効率と遺伝子数、およびトランスクリプト数
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIsを用いて、250 ngのマウス脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理(ZapR treatment)を実施したものと実施しないもので比較した。ZapR treatmentしたものはPCR増幅による濃縮後、ZapR treatmentしないものはそのままシーケンスに使用した。それぞれのライブラリーについて、3×106ペアエンドリードをCogentAPで解析し、リード分布(パネルAとパネルC)と遺伝子数(パネルBとパネルC)を示した。
その結果、ZapR treatmentしたライブラリーでは、遺伝子数が増加した。

内容

SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian)(製品コード 634354/634355/634356)
  • SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs
    Package 1
     ・SMART UMI-TSO Mix v3
    Package 2
     ・SMART Pico Oligos Mix v3
     ・5X First-Strand Buffer
     ・SMARTScribe II Reverse Transcriptase
     ・RNase Inhibitor (40 U/µl)
     ・SeqAmp DNA Polymerase
     ・SeqAmp CB PCR Buffer (2X)
     ・Tris Buffer (5 mM)
     ・PCR2 Primers v3
     ・Nuclease-Free Water
     ・10X Lysis Buffer
  • ZapR Mammalian rRNA Depletion Kit
    Package 1
     ・R-Probes
     ・Control Total RNA (1 µg/µl)
    Package 2
     ・ZapR Enzyme
     ・ZapR Buffer (10X)
* SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs、ZapR Mammalian rRNA Depletion Kitそれぞれの単品販売はありません。

保存

SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs
Package 1:-70℃
Package 2:-20℃
ZapR Mammalian rRNA Depletion Kit
Package 1:-70℃
Package 2:-20℃
(R-Probesは3回以上凍結融解しないでください。凍結融解を避けるため小分け分注することをおすすめします。)

本製品以外に必要な試薬、器具、機器(主なもの)

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。
Index Kit
  • Unique Dual Index Kit (1-24)(製品コード 634756)
    UDI No. U001-U024
  • Unique Dual Index Kit (1-96)(製品コード 634752)
    UDI No, U001-U096
  • Unique Dual Index Kit (97-192)(製品コード 634753)
    UDI No, U097-U192
  • Unique Dual Index Kit (193-288)(製品コード 634754)
    UDI No, U193-U288
  • Unique Dual Index Kit (289-384)(製品コード 634755)
    UDI No, U289-U384
サンプル調製(セルソーティング)
  • 8-tube strips(Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0264)またはセルソーティングに適したPCR tube strips、96 well plates
  • (オプション)BD FACS Pre-Sort Buffer(BD社 Cat. No. 563503)
  • Microplate film(USA Scientific社, Cat. No. 2920-0010)for sealing tubes/plates before sorting
  • Aluminum single tab foil seal(USA Scientific社, Cat. No. 2938-4100)または cap strips(Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0784/AB0850)for sealing tubes/plates after sorting
  • ドライアイス(細胞の凍結用)
  • (オプション)SMART-Seq HT Kit Lysis Components(製品コード 634439)または10× Lysis Buffer(製品コード 635013)
cDNA合成、PCR増幅
  • PCRサーマルサイクラー 2台(cDNA合成用、PCR増幅用)
  • Nuclease-free, PCR-grade, thin-wall PCR strips(0.2 ml PCR 8-tube strip; USA Scientific社, Cat. No.1402-4700)または同様のPCR-grade, thin-wall PCR tubes, strips、96-well plates
  • Nuclease-free, low-adhesion 1.5 ml tubes(USA Scientific社, Cat. No. 1415-2600)、DNA LoBind tubes(Eppendorf社, Cat. No. 022431021)または同様の核酸低吸着性チューブ
  • Thermo Scientific Adhesive PCR Plate Seals(Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0558)for 96-well plates or cap strips(Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0784/AB0850)for 8-tube strips
Beads精製
  • NucleoMag NGS Clean-up and Size Select(5 ml size:製品コード 744970.5;50 ml size:製品コード 744970.50;500 ml size:製品コード 744970.500)
    ※NucleoMagの代わりにAMPure XP PCR purification kit(Beckman Coulter社 5 ml size:Cat. No. A63880;60 ml size:Cat. No. A63881)も使用可能
  • 80%エタノール(用時調製)
  • Magnetic Separation Device
    • 24~96サンプルの場合:Magnetic Stand 96(Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AM10027)、V-bottom plates(500 μl; VWR, Cat. No. 47743-996)、adhesive PCR Plate Seals(Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0558)と組み合わせて使用
    • 1.5 mlチューブ(ライブラリーのプール用)の場合:Magnetic Stand (2 tubes)(製品コード 631964)、8-tube strips(Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0264)、またはnuclease-free, PCR-grade, thin-wall PCR tubes、strips、96-well plates
cDNA定量、ライブラリー定量(必要に応じて選択)
  • High Sensitivity DNA Kit(Agilent Technologies社, Cat. No. 5067-4626)、High Sensitivity D5000 ScreenTape(Agilent Technologies社, Cat. No. 5067-5592)、または同等の高感度電気泳動法
  • Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. P11496)または Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. Q32851 or Q32854)
  • Library Quantification Kit(製品コード 638324)
その他
  • シングルチャンネルピペット:10 μl、20 μlおよび200 μl
  • 8連、あるいは12連チャンネルピペット:10 μl
  • フィルターピペットチップ:10 μl、20 μl、および200 μl
  • 1.5 mlチューブ用微量遠心機
  • 0.2 mlチューブまたはstrip用微量遠心機
注意事項
  • 本ページの製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
  • タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。
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