バイシストロニック(IRES)発現ベクター

Living Colors pIRES2 Vector（図1）には、脳心筋炎ウイルス（ECMV）のIRES（internal ribosomal entry site ; mRNA内部のリボソーム進入サイト）が含まれ、目的遺伝子と蛍光タンパク質マーカー（AcGFP1あるいはZsGreen1、DsRed2、DsRed-Express2）は単一バイシストロン性mRNAとして転写される。リボソームは、バイシストロン性mRNAの5’末端から目的遺伝子を翻訳するだけでなく、IRESの位置にも結合し、蛍光タンパク質遺伝子も翻訳する（1、2）。蛍光タンパク質マーカーは融合タンパク質としてではなく個別に発現し、本ベクターに含まれる完全な活性を有するIRES配列により目的タンパク質と同等の高い発現を示す。このように、蛍光タンパク質発現が検出される細胞のほとんど100％で目的タンパク質も発現しているので、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡^*を用いた簡単なスクリーニングで、目的タンパク質発現クローンを速やかに特定できる。選択した細胞は直接実験に使用できるため、バラツキの少ない安定した結果が得られる。図1に示したプラスミドタイプの製品のほか、レトロウイルスタイプの製品も用意している。

注意：	IRES配列上流のMCSに翻訳されるORFをクローニングしていない状態では、蛍光タンパク質の発現が弱く、蛍光顕微鏡による検出が難しい場合がある。IRES前のMCSに約0.7～1.2 kbの遺伝子を挿入して使用することをお勧めする。

本ベクターでは、目的遺伝子と蛍光タンパク質遺伝子が単一mRNAから同時に翻訳されるため、蛍光タンパク質の発現レベルは目的遺伝子の発現レベルを反映している（注：発現量に相関性が見られるが、同一の発現量ではない）。また、これらは2つの個別のタンパク質として発現するため、目的タンパク質が本来の生物学的機能を損なう危険性ほとんどない（図2）。pIRES2ベクターは、フローサイトメトリーを用いて、一過性に遺伝子導入した細胞群を濃縮する場合や目的遺伝子の発現レベルをモニターする場合に適している。


図1. 蛍光タンパク質搭載pIRES2バイシストロニック発現ベクター



図2. Living Colors pIRES2ベクターからの2つのタンパク質の翻訳

図3. フローサイトメトリーによるLiving Colors pIRES2-ZsGreen1 Vectorの機能確認
pIRES2-ZsGreen1 VectorのマルチクローニングサイトにDsRed-Expressタンパク質をコードする遺伝子を組み込み、細胞に導入した。
パネルA：トランスフェクションしていないコントロール細胞
パネルB：トランスフェクションされた細胞は対角線上に分布し、ZsGreen1とDsRed-Express蛍光タンパク質を同時に発現していることが確認できる。
パネルC：ZsGreen1タンパク質のみを発現するコントロール細胞は、FL-1チャンネルでのみ検出され、X軸に沿って分布が見られた。
パネルD：別途用意したDsRed-Expressタンパク質のみを発現する細胞は、FL-2チャンネルでのみ検出され、Y軸に沿って分布が見られた。
各サンプルの解析は、波長488 nmのレーザー光を用い、FACSCalibur Flow Cytometerで行った。

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