Lenti-X™レポーターシステム

Lenti-X レポーターシステム（表1）は、蛍光アッセイが可能なユニークなレポーター分子をレンチウイルスベクターに組み合わせたシステムで、初代培養細胞やES細胞などさまざまな細胞種でプロモーター活性の研究を可能にする。神経細胞や分化が進んだ非分裂性の細胞にも効率よく導入できる。クロンテック独自の第4世代レンチウイルスパッケージングシステム（各製品に添付）と任意のレンチウイルスベクターを組み合わせて使用する（1）（図1）。
細胞を融解することなく培養を続けながら測定を行えるため、必要な時に何度でもアッセイが行える。細胞数の少ない幹細胞や、短時間に繰り返し測定を行う必要がある実験系などに特に推奨する。

表1. レポーター遺伝子選択の基準

	Lenti-X Ready-To-Glow Secreted Luciferase Reporter System（終売）	Lenti-X DD Fluorescent Protein* Reporter Systems
発光検出（プレートリーダー）	＋
蛍光検出（FACS、蛍光顕微鏡）		＋
自動化システムへの適合性	＋	＋
営利施設の使用時のライセンス契約の有無		＋

* AmCyan1、ZsGreen1またはtdTomato


図1. Lenti-Xレポーターシステムの蛍光アッセイ用レポーターベクターの構造
Lenti-Xレポーターベクターは、レンチウイルスへのパッケージングを容易にし、レポーター遺伝子を高レベルに発現する配列を含んでいる。
DD：ligand-dependent destabilization domain. FP = fluorescent protein (AmCyan1、ZsGreen1または tdTomato).

Lenti-X DD Fluorescent Protein Reporter Systemは蛍光タンパク質レポーター（AmCyan1、ZsGreen1またはtdTomato）とタンパク質分解制御技術であるProteoTunerシステムを組み合わせたもので、レポーター分子（蛍光タンパク質）の発現レベルを自由に調節できる（3）。本システムでは、蛍光タンパク質はN末端に不安定化ドメイン（DD：Destabilization Domain, 12 kDa）を融合して発現する。細胞中で発現したDD融合蛍光タンパク質はプロテアソームにより迅速に分解を受けますが、Shield1を細胞培養液中に添加すると、Shiled1がDDタグに結合し、DD融合蛍光タンパク質を安定化させる。添加するShield1量を調節することで、DD融合タンパク質の量を厳密に制御することができ、また、培地交換により培養液中のShield1を除けば、DD融合タンパク質は再び迅速に分解する（4）（図3）。
転写を活性化する化合物とShield1を同時に培地に加えると、プロモーターの活性化により発現する蛍光タンパク質を効果的に安定化させることができる。Shield1の添加により安定化のタイミングを選択できるため、プロモーター活性化のモニタリングを必要な時にだけ行える。必要時に安定化することで、測定されるレポーター分子の大部分は転写活性化後に発現した分子となる。バックグラウンドの原因となる基底発現レベルのレポーター分子を実質、完全に抑制することができ、広いダイナミックレンジでのアッセイが可能である。（図2）


図2. Lenti-X Reporterシステムの低いバックグラウンドと高いシグナル強度
HEK 293細胞に、pLVX-CRE-DD-ZsGreen1 Reporter Vectorを導入した。フォルスコリン処理後、レポーターによるアッセイを行った。
RFU：相対蛍光単位


図3. リガンド（Shield1）による可逆的で特異的な蛍光タンパク質の安定化
サイズの小さい不安定化ドメイン（DD）タグを蛍光タンパク質に融合し発現させる。膜透過性の低分子化合物Shield1はDDタグに結合し、プロテアソームによるDD融合蛍光タンパク質の分解を防ぎ安定化させる。培地にShield1がない状態ではDD融合蛍光タンパク質は迅速に分解し、バックグラウンドレベルに発現する蛍光が完全に抑えられる。

ご注意：拡散防止措置に関する確認書が必要な製品です。
Lenti-XシリーズのpLVX系レンチウイルスベクターはプロウイルスにおいてLTRのプロモーター活性を持つため、HIV-1の増殖力等欠損株とは見なされません。このため、これらのベクターを用いた遺伝子組換え実験は、遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物多様性の確保に関する法律第13条に基づき、文部科学大臣による拡散防止措置の確認が必要です。
なお、該当製品をご注文の際に、これらのベクターを使用するにあたり文部科学大臣による拡散防止措置の確認を受けていることをご提示いただく確認書「Lenti-Xシリーズレンチウイルスベクター　拡散防止措置に関する確認書」の添付が必要です。
詳細はこちらをご確認ください。