In-Fusion^® HD Cloning Plus

ClontechのIn-Fusionクローニングシステムは、それぞれのDNA断片の末端15塩基が相同であれば、短時間に効率よく、In-Fusion酵素がそれらのDNA断片を融合することができる。制限酵素切断や平滑末端化処理、リガーゼ反応などを行うことなく、1ステップの反応でPCR断片を任意のベクターにクローニングできる。In-Fusion HD Cloning Kitはプレミックスタイプであり、反応時間はわずか15分^※、クローニング効率が高く、質の高いクローニングを行える。
効率のよいIn-Fusionクローニングなら、最小限のスクリーニングで適切なクローンが得られる。また、2つのDNA断片の結合のみならず、1度の反応で4つのDNA断片を適切に連結することも可能である（1）。In-Fusionクローニング法はハイスループット（HTP）な系にも有用であり、ハーバード大学医学部（2）やスタンフォード大学医学部（3）、オックスフォード大学（4）などのHTPプロジェクトでも活躍している。
In-Fusion HD Cloning Plusシリーズは、クロンテック製高正確性PCR酵素「CloneAmp HiFi PCR Premix」および形質転換効率の高いコンピテントセル「Stellar Competent Cells」が入ったオールインワンキットである。
※EcoDryは凍結乾燥タイプで、反応時間は37℃ 15分＋50℃ 15分である。

　※EcoDryタイプの場合は37℃ 15分＋50℃ 15分です。
図1. In-Fusionクローニング

1. 利用するベクターの末端配列に相同な15塩基を、目的遺伝子増幅用プライマーの5'末端に付加し、目的遺伝子をPCR増幅する。
2. 増幅産物がシングルバンドであればCloning Enhancer処理^＊1を行い、複数のバンドが見られる場合はゲルから精製^＊2して、In-Fusion酵素で線状化ベクター^＊3と結合する（In-Fusion反応：50℃、15分／EcoDryタイプは37℃ 15分＋50℃ 15分）。
   製品名に「CE」が付くキットに含まれるCloning Enhancerは、PCR産物をそのままIn-Fusion反応に使用するための独自の前処理試薬である。PCR終了後の反応液に本試薬を加えて30分間インキュベートするだけで、そのままIn-Fusion反応に使用できる。PCR産物の精製ステップが不要となり、試料のロスも少なくなる。
3. In-Fusion反応液で形質転換を行い、目的クローンをスクリーニングする。

＊1　Cloning Enhancerを含むセットが便利です（製品コード 638916～638918）。Cloning Enhancerのみの別売もあります（製品コード 639613～639615）。
＊2　精製用カラムNucleoSpinを含むセットが便利です（製品コード 638909～638920、638913）。
＊3　線状化ベクターは、制限酵素処理や全長のPCR増幅により調製してください。

In-Fusionクローニング製品選択ガイド

In-Fusionクローニング用プライマーの設計および目的DNA断片の増幅は、基本的に通常のPCRプライマーの設計、PCR増幅と同じである。唯一の違いは、利用するベクターの末端配列に相同な15塩基を、配列特異的プライマーの5’末端に付加することである（下図参照）。

お手持ちのベクターに対するIn-Fusion用プライマーの設計には、便利なオンラインツール「In-Fusion クローニング用プライマー設計サイト（In-Fusion Cloning Primer Design Tool）」をご利用ください。

※ リンク先はTB USA社サイトです。デザインツールが更新され、より使いやすくなりました。


※ これまでお使いいただいていた「In-Fusionクローニング用プライマー設計サイト（Primer Design tool for In-Fusion）」はこちらから

In-Fusionクローニング製品選択ガイド

In-Fusion HD Cloning Plus
（製品コード 638909、638910、638911）
・5×In-Fusion HD Enzyme Premix
・pUC19 Control Vector, linearized
・2 kb Control Insert
・CloneAmp HiFi PCR Premix^＊1
・Stellar Competent Cells^＊2
・NucleoSpin Gel and PCR Clean-up^＊3

In-Fusion HD Cloning Plus CE
（製品コード 638916、638917、638918）
・5×In-Fusion HD Enzyme Premix
・pUC19 Control Vector, linearized
・2 kb Control Insert
・CloneAmp HiFi PCR Premix^＊1
・Stellar Competent Cells^＊2
・Cloning Enhancer^＊4

In-Fusion HD EcoDry Cloning Plus
（製品コード 638913）
・In-Fusion HD EcoDry Mix
・pUC19 Control Vector, linearized5 μl
・2 kb Control Insert
・CloneAmp HiFi PCR Premix^＊1
・Stellar Competent Cells^＊2
・NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit^＊3

*1　高正確性PCR酵素
*2　形質転換効率の高いコンピテントセル
*3　PCR産物精製用スピンカラム
*4　PCR産物をそのままIn-Fusion反応に使用するための前処置試薬

In-Fusion HD EcoDry Mix：デシケーター内で室温保存
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up：室温
Stellar Competent Cells：－80℃
その他：－20℃