SMARTer^® smRNA-Seq Kit for Illumina^®

small non-coding RNA(smRNA)の新規検索や解析は遺伝子発現調節を知る上で重要であり、現在知られているmiRNA、siRNA、piRNA、snoRNAなどのsmRNAは、主に20～30塩基のサイズに分布している。
SMARTer smRNA-Seq Kit for Illuminaは、1 ng～2 μgのtotal RNA、またはsmall RNAサンプルからイルミナ社次世代シーケンサー用のsmRNA-Seqライブラリーを作製するキットである。本製品は、SMART（Switching Mechanism at 5’End of RNA Template）テクノロジーとLNAテクノロジーを利用したSMART-Seq v4 kit技術を用いており、Ligationを行うことなくIlluminaアダプター、インデックスを付加することができ、バイアスの少ないライブラリーを作製することが可能である。

本製品は、total RNAまたはsmall RNAからライブラリー調製が可能である。total RNAを用いる場合は、ライブラリー作製後、SPRI Bead精製またはBluePippin Systemによるサイズ分画が必要である。

また、本キットにはインデックスプライマーが含まれているが、インデックスホッピング低減のためのユニークデュアルインデックスキット（別売）も使用可能である。

図1．SMARTer smRNA-Seq Kit for Illuminaを用いたライブラリー作製の概要
まず、Oligo(dT)プライマーをアニーリングさせるために、インプットRNAの3’末端にpoly A配列を付加する（3’polyadenylation）。
次に3’smRNA dT Primerを用いてcDNA合成を行う。3’smRNA dT Primerの5’末端には1st アダプター配列(緑)が付加されており、逆転写反応によってcDNAにアダプター配列が付加される。更にMMLV由来の逆転写酵素PrimeScript Reverse TranscriptaseがRNAの5’末端に達すると、SMART法の原理により、cDNA鎖の末端に短い配列（xxxxx）が付加され、そこにSMART smRNA Oligoがハイブリダイズする。逆転写酵素は鋳型を乗り換え、SMART smRNA Oligoの末端までcDNA合成を続ける。なお、SMART smRNA OligoにはLNAテクノロジーが利用されており、SMART Oligoの感度が向上している。SMART smRNA Oligoには2nd アダプター配列(紫)が付加されているため、合成されたcDNAの3’末端に2ndアダプター配列が付加される。
続くPCR増幅のステップで、cDNAにマルチプレックス用のIlluminaアダプター配列、およびインデックス配列を付加する。Forward PCR PrimerはSMART smRNA Oligoの2ndアダプター 配列(紫)に結合し、Reverse PCR Primer は3’smRNA dT Primerの1stアダプター配列(緑)に結合する。その結果、Illuminaフローセルに必要なアダプター配列（P5：水色、P7：赤）とインデックス配列（Index 2 [i5]：オレンジ、Index 1 [i7]：黄色）がライブラリーのcDNAに付加される。
（注）最終的なライブラリーには、RNA配列に153 bpのアダプター配列が付加される。


図2．small RNA-Seqライブラリーの正確性
SMARTer smRNA-Seq Kit for Illuminaを用いて、963種類の合成miRNAを等モルずつ混合したmiRNAプール（miRXplore Universal Reference）1 ngからライブラリーを作製した（紫）。
また、比較のため、他社製品（Adapter ligation）を用いてmiRXplore Universal Reference 100 ngからライブラリーを作製した（青）。それぞれのシーケンス結果をマッピングしてリード数をカウントし、発現レベルを調べた。miRNA発現レベル（Y軸；対数表示）は、各miRNAで予想される発現レベルが全て1となるようにノーマライズし、上下2倍をカットオフとして2本の線で示した。なお、視覚化のため、X軸は発現レベル順にmiRNAを整列させた。


図3．データの再現性
SMARTer smRNA-Seq Kit for Illuminaを用いて各1 ngのhuman brain total RNA 2サンプルよりRNA-Seqライブラリーを作製し、BluePippin system（Sage Science社）を用いてサイズセレクションを行った。シーケンス結果をマッピングし、各ライブラリーで同定されたmiRNAの発現レベルの相関性を調べた（A）。また、1 ng、および2 μgのhuman brain total RNAからライブラリーを作製、シーケンス、マッピングを行い、各ライブラリーの相関性を調べた（B）。

SMARTer smRNA-Seq Kit for Illumina Components
　Package 1
　　・Control RNA - miR163s (10 ng/μl)
　　・smRNA Mix 2
　Package 2
　　・smRNA Mix 1
　　・ATP
　　・RNase Inhibitor (40 U/μl)
　　・Poly(A) Polymerase (2 U/μl)
　　・3’smRNA dT Primer
　　・PrimeScript RT (200 U/μl)
　　・Nuclease-Free Water
　　・Tris Buffer (5 mM)

SeqAmp DNA Polymerase（製品コード 638504、または638509）
　　・SeqAmp DNA Polymerase
　　・SeqAmp PCR Buffer (2X)

Indexing Primer Set HT for Illumina
　　Indexing Primer Set HT for Illumina - 12
　　Forward PCR Primer HT Index 2
　　Reverse PCR Primer HT Index 1～12
　　　　12回用（製品コード 635029）に添付
　　Indexing Primer Set HT for Illumina - 48 A
　　Forward PCR Primer HT Index 1～4
　　Reverse PCR Primer HT Index 1～12
　　　　48回用（製品コード 635030）に添付
　2 X Indexing Primer Set HT for Illumina
　　Forward PCR Primer HT Index 1～8
　　Reverse PCR Primer HT Index 1～12
　　　　96回用（製品コード 635031）に添付

NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up（製品コード 740609.50、または740609.250）

SMARTer smRNA-Seq Kit for Illumina Components
　　Package 1：－70℃
　　Package 2：－20℃
SeqAmp DNA Polymerase：－20℃
Indexing Primer Set HT for Illumina：－20℃
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up：室温

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

PCR増幅およびバリデーション：
・First-Strand cDNA合成専用のPCRサーマルサイクラー
・Double-Strand cDNA増幅専用のPCRサーマルサイクラー
• Agilent Bioanalyzer and Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent社 Code 5067-4626)
(注)ライブラリーのバリデーションには、Advanced Analytical Fragment Analyzerと High Sensitivity Small Fragment Kit (Advanced Analytical, Code DNF-477) の組み合わせも使用可能
• Qubit Fluorometer、Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社 Code Q32851)、500-μl Assay Tube (Thermo Fisher Scientific社 Code Q32856)
• Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Code 1402-4700）
• Nuclease-free low adhesion 1.5 ml tube（USA Scientific社 Code 1415-2600）またはLoBind tube（Eppendorf社 Code 022431021）

サイズセレクション（SPRI Bead精製；Protocol V.E）
• Agencourt AMPure XP PCR purification kit（5 ml Beckman Coulter社 Code A63880、60 ml Beckman Coulter社 Code A63881）
・Small volume用Magnetic stand：Magnetic Separator - PCR Strip（製品コード 635011）
・80％ Ethanol

サイズセレクション（BluePippin System使用；Protocol V.F）
• BluePippin Size Selection System（Sage Science社 Code BLU0001）
• BluePippin 3％ Agarose Gel Cassettes—for targets between 90 bp－250 bp（Sage Science社 Code BDF3010）

その他
・シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl　各2セット
・8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
・フィルターピペットチップ： 2 μl、20 μlおよび200 μl
・1.5 ml tube用minicentrifuge
・0.2 ml tubeまたはstrip用minicentrifuge
・96～100％エタノール
・96 wellクーラーラック： IsoFreeze PCR Rack（MIDSCI社 Code 5640-T4）、または 96-Well Aluminum Block（Light Labs社 Code A-7079）