SMARTer^® Target RNA Capture for Illumina^®

SMARTer Target RNA Capture for Illuminaは、Targeted RNA-Seq用のcDNAを調製するシステムである。Targeted RNA-Seqは、total RNAから目的のtranscriptを濃縮することにより、微量に存在するターゲット配列を高感度に検出でき、高いシーケンスカバー率を取得できる。更に、解析をシンプルにし、解析コストが削減できるという利点もある。
cDNA合成前に目的のtranscriptを濃縮にすることによって、キメラ融合遺伝子、アイソフォーム、スプライシングバリアントなど、全トランスクリプトーム解析では検出しにくく、検出に大量のリード数が必要となるtranscriptの情報を得ることが可能となる。検出感度の向上によって、微量のRNAからも信頼性の高い解析が可能になる。
SMARTer Target RNA Capture for Illuminaのワークフローには、ビオチン化DNAプローブ^*1とtotal RNAを4時間以内にハイブリダイズするステップ、余剰プローブの除去精製、ストレプトアビジン磁性ビーズ（Capture Beads）によるターゲット配列の捕捉のステップが含まれている。Capture Beadsは、タンパク質、核酸低吸着性で逆転写反応、PCR反応を阻害しないため、ビーズ上でcDNA合成を行うことが可能である。
本製品は、高感度なSMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencingの手法を利用しているため、濃縮したトランスクリプトから高品質なcDNA全長配列が作製できる。また、わずか10 ngのtotal RNA^*2を出発材料とするようにデザインされており、100 pgのtotal RNAを用いた成功例もある（TECH NOTE参照）。分解の少ない高純度なtotal RNAを出発材料としてデザインされており、逆転写反応にはOligo dTプライマーを用いるためrRNA除去のステップや試薬は不要で、本製品にはイルミナ社シーケンサーのプラットフォームに適したcDNA調製に必要な試薬が全て含まれている。transcriptの濃縮に用いるCapture Beadsはキットに含まれている他、別売も用意されている。cDNA調製後は、イルミナ社のNextera XT DNA Sample Preparation Kitを用いてライブラリーを作製する。

*1　ターゲット特異的な60 merのビオチン標識プローブが必要
*2　total RNA　1 μgまで使用可能

図1．SMARTer Target RNA Capture for Illuminaを用いたライブラリー作製の概要
RNAサンプルからのrRNAの除去は不要で、ハンズオンタイムは実質2.5～3時間、2日間でライブラリー作製が完了する。


図2．Bioanalyzerでの解析例
パネルAは、ポジティブコントロールとしてキット添付のControl Total RNAとHPRT1Control ProbeをハイブリダイズさせてCapture Beadsで捕捉、SMART-Seq v4による逆転写後、20 CycleのPCR増幅を行った。その結果、1,400～1,650 bpの間にシングルピークが見られた。パネルB（no RNA)、パネルC（no probe）は、パネルAと同じ条件で実施したネガティブコントロールで、いずれもピークは見られなかった。パネルDはControl RNA　10 ngと10種類の異なる遺伝子に対するプローブをハイブリダイズさせ、17 CycleのPCR増幅を行って得られた結果で、cDNAのプロファイルを示している。

Control Total RNA： －70℃.
Capture Beads：4℃(凍結不可)
その他のコンポーネント：－20℃
　（10X Lysis Buffer：融解後は4℃保存。Elution Buffer、10X SSC、1X Wash Buffer、DMSO：融解後は室温保存）

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

ターゲット特異的プローブ
ターゲット特異的な60 merのビオチン標識プローブ

PCR増幅およびバリデーション：
・Hybridization、およびFirst-Strand cDNA 合成専用のPCRサーマルサイクラー
・Double-Strand cDNA 増幅専用のPCRサーマルサイクラー
・High Sensitivity DNA Kit（Agilent社 Code 5067-4626）

SPRI Bead精製：
・Agencourt AMPure PCR Purification Kit（5 ml Beckman Coulter社 Code A63880 ; 60 ml Beckman Coulter社 Code A63881）

Capture Beads：
・Tube rotator（SilentShake Revolver社Code HYQ-1130A; Sections V.B and V.D、または同等品)

シーケンスライブラリー作製：
・Nextera XT DNA Sample Preparation Kit（Illumina社 Code FC-131-1024, FC-131-1096）

その他
・シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl
・12連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
・フィルターピペットチップ： 10 μl、20 μlおよび200 μl
・1.5 ml tube用minicentrifuge
・0.2 ml tubeまたはstrip用minicentrifuge
・Magnetic separation device 2個（1個はPCR前、1個はPCR後に使用）
Magnetic Separator - PCR Strip(製品コード 635011)、または96-well magnetic separation device (Thermo Fisher Scientific社 Code AM10027)
・Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Code 1402-4700）、tube strip、または96well Plate(0.2-ml PCR 8-tube strip; USA Scientific社Code.1402-4700、または 96-well V-bottom Plate, 500 μl; VWR社 Code 47743-996を推奨)
・Nuclease-free low adhesion 1.5 ml tube（USA Scientific社 Code 1415-2600）