SMART-Seq^® Total RNA Single Cell (ZapR™ Mammalian)

SMART-Seq Total RNA Single Cell (ZapR Mammalian)は、1～1,000個のインタクトな細胞または10 pg～10 ngのtotal RNAからイルミナ社次世代シーケンサー対応のライブラリー調製ができるキットで、シングルセルから高感度に再現性の高いデータが取得できるようにデザインされています。本キットは、SMART（Switching Mechanism at 5’ End of RNA Template）テクノロジーを用いており、逆転写およびPCR増幅ステップでインデックスとアダプターを組み込むシームレスなワークフローによって、7時間以内に方向性情報を保持したライブラリーが調製できます。また、ランダムプライマーを用いてcDNA合成を行うため、polyAの有無に関わらず全てのトランスクリプトをキャプチャーでき、分解の進んだ低品質RNAでも使用可能です。さらに、本キットのワークフローにはrRNA特異的プローブを使用した独自技術によってrRNA（および一部ミトコンドリアRNA）由来のcDNAを除去する工程が含まれているため、別途リボゾームRNA除去試薬を用意する必要はなく、rRNAへのマッピングが低い再現性の高いデータが得られます。既存製品と比べてrRNA除去試薬の性能が向上しているため、より高精度の解析が行えます（図5）。
別売りのUnique Dual Index Kit（製品コード 634752～634756）と組み合わせることにより、最大384サンプルのマルチプレックス解析に対応可能です。

図1．実験フローチャート


図2．SMART-Seq Total RNA Single Cell (ZapR Mammalian)を用いて調製された最終ライブラリーの構造
Unique Dual Index Kit（製品コード 634752～634756）を用いて付加された配列には、イルミナ社シーケンサーのフローセルでクラスタリングできる配列（P7、P5、Index 1 [i7]、Index 2 [i5]）と、シーケンスプライマーRead 2およびRead 1を認識する領域が含まれている。Read 1では元のRNAのアンチセンス側の配列が得られ、Read 2では元のRNAのセンス側の配列が得られる。Read 2の最初の3塩基（XXX）はSMART Adapter由来の配列となるため、paired-end sequencingを行った場合、この3塩基はマッピングの前にトリミングする必要がある。




図3．異なるRNAインプット量から調製したライブラリーのrRNA由来cDNA除去効果
本製品に含まれるSMART-Seq Total RNA Single Cellを用いて10 pgおよび10 ngのヒト脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理（ZapR treatment）を実施したものと実施しないもので比較した。ZapR treatmentしたものはPCR増幅による濃縮後、ZapR treatmentしないものはそのままシーケンスに使用した。それぞれのライブラリーについて、2×10⁶ペアエンドリードをCogentAPで解析し、その結果を棒グラフ（パネル A）と表（パネル B）に示した。10 pg、10 ngのいずれのインプット量でも、ZapR trearment処理後のrRNA readsの割合は5％以下となっており、幅広いレンジでrRNA由来cDNAが効率よく除去されることが示された。




図4．異なるRNAインプット量から調製したライブラリーの遺伝子数とトランスクリプト数の評価
SMART-Seq Total RNA Single Cellを用いて10 pgおよび10 ngのヒト脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理（ZapR treatment）を実施したものと実施しないもので比較した。ZapR treatmentしたものはPCR増幅による濃縮後、ZapR treatmentしないものはそのままシーケンスに使用した。それぞれのライブラリーについて、2×10⁶ペアエンドリードをCogentAPで解析し、得られた遺伝子数（パネル A）、およびトランスクリプト数（パネル B）を示した。ZapR treatmentしたライブラリーでは、遺伝子数、トランスクリプト数が増加しており、キットの有効性が示された。

＜参考データ＞
本製品に含まれるrRNA除去試薬ZapR Mammalian rRNA Depletion Kitは、SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian)（製品コード 634354：日本発売準備中）に含まれるものと同じ製品です。SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian)のアプリケーションデータの一つとして取得されたrRNA除去試薬の新旧比較データを図5として示します。


図5．rRNA除去試薬の新/既存製品比較
SMART-Seq Total RNA Pico Input (with UMIs)（新製品）を用いて、250 ngのヒト脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理（ZapR treatment）を実施し、PCR増幅により濃縮した。コントロールとしてZapR treatmentしていないライブラリーをそのまま用いた（No depletion）。更に、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian（既存製品）を用いて、250 ngのヒト脳RNAからライブラリーを調製した。
それぞれのライブラリーについて、3×10⁶ペアエンドリードをCogentAPで解析し、リード分布を比較した。
ZapR Mammalian rRNA Depletion Kitで処理したライブラリーのリード分布は、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalianで調製したライブラリーと比較したところ、rRNAのリードの割合が減少してExonのリードの割合が増加し、rRNA除去試薬の性能向上が示された。

SMART-Seq Total RNA Single Cell (ZapR Mammalian)

• SMART-Seq Total RNA Single Cell^＊
  Package 1
  • SMART scTSO Mix
  Package 2
  • SMART scN6
  • scRT Buffer
  • SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)
  • RNase Inhibitor (40 U/μl)
  • SeqAmp DNA Polymerase
  • SeqAmp CB PCR Buffer (2X)
  • Tris Buffer (5 mM)
  • PCR2 Primers
  • Nuclease-Free Water
  • 10X Lysis Buffer


• ZapR Mammalian rRNA Depletion Kit^＊
  Package 1
  • R-Probes
  • Control Total RNA (1 μg/μl)
  Package 2
  • ZapR Enzyme
  • ZapR Buffer (10X)
  
  ＊ SMART-Seq Total RNA Single Cell、ZapR Mammalian rRNA Depletion Kitそれぞれの単品販売はありません。

SMART-Seq Total RNA Single Cell
Package 1：－70℃
Package 2：－20℃
（10X Lysis Buffer：融解後は4℃保存）

ZapR Mammalian rRNA Depletion Kit
Package 1：－70℃
Package 2：－20℃
（R-Probesは3回以上凍結融解しないでください。凍結融解を避けるため小分け分注することをおすすめします。）

下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替できないため、ご注意ください。

Index Kit
Unique Dual Index Kit (1-24)（製品コード 634756）
UDI No, U001-U024
Unique Dual Index Kit (1-96)（製品コード 634752）
UDI No, U001-U096
Unique Dual Index Kit (97-192)（製品コード 634753）
UDI No, U097-U192
Unique Dual Index Kit (193-288)（製品コード 634754）
UDI No, U193-U288
Unique Dual Index Kit (289-384)（製品コード 634755）
UDI No, U289-U384

サンプル調製（セルソーティング）

• 8-tube strips（Thermo Fisher Scientific, Cat. No. AB0264）またはセルソーティングに適したPCR tube strips、96 well plates
• （オプション）BD FACS Pre-Sort Buffer（BD Cat. No. 563503）
• Microplate film（USA Scientific, Cat. No. 2920-0010） for sealing tubes/plates before sorting
• Aluminum single tab foil seal（USA Scientific, Cat. No. 2938-4100）または cap strips（Thermo Fisher Scientific, Cat. No. AB0784/AB0850）for sealing tubes/plates after sorting
• ドライアイス（細胞の凍結用）
• (オプション) SMART-Seq HT Kit Lysis Components（製品コード 634439）または10×Lysis Buffer（製品コード 635013）
• 96-well plate用卓上低速遠心機

cDNA合成、PCR増幅

• PCRサーマルサイクラー　2台（cDNA合成用、PCR増幅用）
• Nuclease-free, PCR-grade, thin-wall PCR strips （0.2 ml PCR 8-tube strip; USA Scientific, Cat. No.1402-4700）または同様のPCR-grade, thin-wall PCR tubes, strips、96-well plates
• Nuclease-free, low-adhesion 1.5 ml tubes（USA Scientific, Cat. No. 1415-2600）、DNA LoBind tubes（Eppendorf, Cat. No. 022431021）または同様の核酸低吸着性チューブ
• Thermo Scientific Adhesive PCR Plate Seals （Thermo Fisher Scientific, Cat. No. AB0558）for 96-well plates or cap strips（Thermo Fisher Scientific, Cat. No. AB0784/AB0850）for 8-tube strips

Beads精製

• NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（5 ml size：製品コード 744970.5；50 ml size：製品コード 744970.50；500 ml size：製品コード 744970.500）
  ※NucleoMagの代わりにAMPure XP PCR purification kit（Beckman Coulter 5 ml size：Cat. No. A63880；60 ml size：Cat. No. A63881）も使用可能
• 80％エタノール（用時調製）
• Magnetic Separation Device
• 24～96サンプルの場合：Magnetic Stand 96（Thermo Fisher Scientific Cat. No. AM10027）、V-bottom plates （500 μl; VWR, Cat. No. 47743-996）、adhesive PCR Plate Seals（Thermo Fisher Scientific, Cat. No. AB0558）と組み合わせて使用
• 1.5 mlチューブ（ライブラリーのプール用）の場合：Magnetic Stand (2 tubes)（製品コード 631964）、8-tube strips （Thermo Fisher Scientific, Cat. No. AB0264）、またはnuclease-free, PCR-grade, thin-wall PCR tubes、strips、96-well plates

cDNA定量、ライブラリー定量（必要に応じて選択）

• High Sensitivity DNA Kit（Agilent Technologies, Cat. No. 5067-4626）、High Sensitivity D5000 ScreenTape （Agilent Technologies, Cat. No. 5067-5592）、または同等の高感度電気泳動法
• Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Thermo Fisher Scientific, Cat. No. P11496）または Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific, Cat. No. Q32851 or Q32854）
• Library Quantification Kit（製品コード 638324）

その他

• シングルチャンネルピペット：10 μl、20 μlおよび200 μl、1,000 μl
• 8連、あるいは12連チャンネルピペット：20 μl、200 μl
• フィルターピペットチップ：2 μl、10 μl、20 μl、200 μl、および1,000 μl
• 1.5 mlチューブ用微量遠心機
• 0.2 mlチューブまたはstrip用微量遠心機
• IsoFreeze PCR Rack（MIDSCI, Cat. No. 5640-T4）または96-Well Aluminum Block（Light Labs, Cat. No. A-7079）等の96-well PCR chiller rack
• VWR CryoCoolers（VWR, Cat. No. 414004-286）等の卓上クーラー