SMART-Seq^® Total RNA Pico Input (ZapR™ Mammalian)

SMART-Seq Total RNA Pico Input (ZapR Mammalian)は、250 pg～10 ngのヒト、マウス、ラットのtotal RNAから、イルミナ社次世代シーケンサー対応のライブラリーを調製するキットです。高品質のRNAはもちろん、FFPEやLCMサンプルから調製された分解の進んだ低品質RNAも使用することができます。本キットは、SMART（Switching Mechanism at 5' End of RNA Template）テクノロジーを用いており、逆転写およびPCR増幅ステップでインデックスとアダプターを組み込むシームレスなワークフローにより、6時間以内にStrand情報を保持したライブラリーを調製できます。
本キットのワークフローにはrRNA特異的プローブを使用した独自技術によってrRNA（および一部ミトコンドリアRNA）由来のcDNAを除去する工程が含まれているため、別途リボゾームRNA除去試薬を用意する必要はなく、rRNAへのマッピングが低い再現性の高いデータが得られます。
また、本キットは大量のPhiXを添加しなくても高いクラスターpassing filter（% PF）を得ることができます。その結果、一回のシーケンスで生物学的に有意義なリードをより多く得ることができ、シーケンスコストを下げることができます。
別売りのUnique Dual Index Kit（製品コード 634752～634756）と組み合わせることにより、最大384サンプルのマルチプレックス解析に対応可能です。

本製品に含まれるrRNA除去試薬ZapR Mammalian rRNA Depletion Kitは、SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian)（製品コード 634354）に含まれるものと同じ製品です。SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian)のアプリケーションデータの一つとして取得されたrRNA除去試薬の新旧比較データを図6として示します。

図6．rRNA除去試薬の新／既存製品比較
SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs（新製品）を用いて、250 ngのヒト脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理（ZapR treatment）を実施し、PCR増幅により濃縮した。コントロールとしてZapR treatmentしていないライブラリーをそのまま用いた（No depletion）。更に、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian（既存製品）を用いて、250 ngのヒト脳RNAからライブラリーを調製した。
それぞれのライブラリーについて、3×10⁶ペアエンドリードをCogentAPで解析し、リード分布を比較した。
ZapR Mammalian rRNA Depletion Kitで処理したライブラリーのリード分布は、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalianで調製したライブラリーと比較したところ、rRNAのリードの割合が減少してExonのリードの割合が増加し、rRNA除去試薬の性能向上が示された。

SMART-Seq Total RNA Pico Input (ZapR Mammalian)

• SMART-Seq Total RNA Pico Input^＊
  Package 1
  　・SMART TSO Mix v2
  Package 2
  　・SMART Pico Oligos Mix v2
  　・5X First-Strand Buffer
  　・SMARTScribe Reverse Transcriptase
  　・RNase Inhibitor (40 U/μl)
  　・SeqAmp DNA Polymerase
  　・SeqAmp CB PCR Buffer (2X)
  　・Tris Buffer (5 mM)
  　・PCR2 Primers v2
  　・Nuclease-Free Water
• ZapR Mammalian rRNA Depletion Kit^＊
  Package 1
  　・R-Probes
  　・Control Total RNA (1 μg/μl)
  Package 2
  　・ZapR Enzyme
  　・ZapR Buffer (10X)

* SMART-Seq Total RNA Pico Input、ZapR Mammalian rRNA Depletion Kitそれぞれの単品販売はありません。

SMART-Seq Total RNA Pico Input

Package 1：－70℃

Package 2：－20℃

ZapR Mammalian rRNA Depletion Kit

Package 1：－70℃

Package 2：－20℃

（R-Probesは3回以上凍結融解しないでください。凍結融解を避けるため小分け分注することをお勧めします。）

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。

Index Kit

• Unique Dual Index Kit (1-24)（製品コード 634756）
  UDI No. U001-U024
• Unique Dual Index Kit (1-96)（製品コード 634752）
  UDI No, U001-U096
• Unique Dual Index Kit (97-192)（製品コード 634753）
  UDI No, U097-U192
• Unique Dual Index Kit (193-288)（製品コード 634754）
  UDI No, U193-U288
• Unique Dual Index Kit (289-384)（製品コード 634755）
  UDI No, U289-U384

サンプル調製（セルソーティング）

• 8-tube strips（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0264）またはセルソーティングに適したPCR tube strips、96 well plates
• Microplate film（USA Scientific社, Cat. No. 2920-0010）for sealing tubes/plates before sorting
• Aluminum single tab foil seal（USA Scientific社, Cat. No. 2938-4100）または cap strips（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0784/AB0850）for sealing tubes/plates after sorting

cDNA合成、PCR増幅

• PCRサーマルサイクラー　2台（cDNA合成用、PCR増幅用）
• Nuclease-free, PCR-grade, thin-wall PCR strips（0.2 ml PCR 8-tube strip; USA Scientific社, Cat. No.1402-4700）または同様のPCR-grade, thin-wall PCR tubes, strips、96-well plates
• Nuclease-free, low-adhesion 1.5 ml tubes（USA Scientific社, Cat. No. 1415-2600）、DNA LoBind tubes（Eppendorf社, Cat. No. 022431021）または同様の核酸低吸着性チューブ
• Thermo Scientific Adhesive PCR Plate Seals（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0558）for 96-well plates or cap strips（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0784/AB0850）for 8-tube strips

Beads精製

• NucleoMag NGS Clean-up and Size Select（5 ml size：製品コード 744970.5；50 ml size：製品コード 744970.50；500 ml size：製品コード 744970.500） NucleoMagの代わりにAMPure XP PCR purification kit（Beckman Coulter社 5 ml size：Cat. No. A63880；60 ml size：Cat. No. A63881）も使用可能
• 80％エタノール（用時調製）
• Magnetic Separation Device
  • 24～96サンプルの場合：Magnetic Stand 96（Thermo Fisher Scientific社 Cat. No. AM10027）、V-bottom plates（500 µl; VWR, Cat. No. 47743-996）、adhesive PCR Plate Seals（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0558）と組み合わせて使用
  • 1.5 mlチューブ（ライブラリーのプール用）の場合：Magnetic Stand (2 tubes)（製品コード 631964）、8-tube strips（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. AB0264）、またはnuclease-free, PCR-grade, thin-wall PCR tubes、strips、96-well plates

cDNA定量、ライブラリー定量（必要に応じて選択）

• High Sensitivity DNA Kit（Agilent Technologies社, Cat. No. 5067-4626）、High Sensitivity D5000 ScreenTape（Agilent Technologies社, Cat. No. 5067-5592）、または同等の高感度電気泳動法
• Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社, Cat. No. Q32851 or Q32854）
• Library Quantification Kit（製品コード 638324）

その他

• シングルチャンネルピペット：10 μl、20 μlおよび200 μl
• 8連、あるいは12連チャンネルピペット：10 μl
• フィルターピペットチップ：10 μl、20 μl、および200 μl
• 1.5 mlチューブ用微量遠心機
• 0.2 mlチューブまたはstrip用微量遠心機