Campylobacter (cdt gene) PCR Detection and Typing Kit

カンピロバクターによる食中毒の発生件数は近年増加の傾向にあり、主要な食中毒原因菌のひとつとして注目されている。カンピロバクター属菌は酸素が3～10％の微好気条件下で増殖する螺旋状グラム陰性細菌である。カンピロバクターが引き起こす主たる症状は腸炎であるが、その原因菌の約90％がCampylobacter jejuni（以下C. jejuni）であり、数％がCampylobacter coli（以下C. coli）と言われている。また、Campylobacter fetus（以下C. fetus）は、敗血症や髄膜炎などの検査材料からも分離されており、これらの病態の原因菌の一つと考えられている。このように菌種によって症状が異なることから、菌の検出と合わせて菌種の同定も非常に重要とされている。現在、カンピロバクターの検出・同定は培養法によって行われているが、菌の増殖が遅いため前培養で最低2日かかり、さらに数日間の菌種同定培養試験が必要なため、カンピロバクターの確実な菌種同定には1週間程度を要します。そのため、PCR法等の遺伝子検出技術を応用した迅速な検出・同定法が待ち望まれていた。
本キットは、カンピロバクター属菌が保有するCytolethal distending toxin遺伝子（cdt genes）のBサブユニット遺伝子（cdtB gene）又はCサブユニット遺伝子（cdtC gene）をターゲットとして、C. jejuni、C. coli、C. fetusの3菌種を特異的かつ迅速にPCRで検出・同定できる。カンピロバクター属菌の中には、まれにcdtB geneやcdtC geneに欠損や変異を持つ菌株が存在するので、検出精度を高める目的で、cdtB geneとcdtC geneの2つの遺伝子の増幅検出を行う。本キットの増幅にはHot Start PCR用酵素、TaKaRa Ex Taq HSを使用しており、反応液調製時などサイクル前のミスプライミングやプライマーダイマーに由来する非特異的増幅を防ぐことができ、高感度の検出が可能である。

本キットの製品化にあたりましては、大阪府立大学および扶桑薬品工業株式会社のご協力をいただきました。

（50 μl反応系、100回用^*1）

1．	Premix Ex Taq HS*2（2×conc.）	500 μl×5
2．	cdtB Primer Mix	250 μl
3．	cdtC Primer Mix	250 μl
4．	dH2O	1 ml×3
5．	C. jejuni Positive Control	150 μl
6．	C. coli Positive Control	150 μl
7．	C. fetus Positive Control	150 μl

*1 cdtB遺伝子検出50反応、cdtC遺伝子検出50反応用
*2 TaKaRa Ex Taq HS、反応Buffer、dNTP mixtureを含む2倍濃度のPCR反応試薬。凍結融解の繰り返しにより活性が低下する恐れがあるため、融解後はPCR用のチューブに25 μlずつ小分けして－20℃で保存してください。

－20℃

本キットを用いた検出過程では、さらに次のような試薬、機器が必要です。
【試薬】

1. 滅菌精製水
2. アガロースゲル
   PrimeGel Agarose PCR-Sieve （製品コード 5810A）
3. 電気泳動用buffer
   Tris-Acetate-EDTA Buffer (TAE) 50×Powder, pH8.3（製品コード T9131）
   またはTBE (Tris-borate-EDTA) powder（製品コード T905）
4. DNA マーカー
   100 bp DNA ladder（製品コード 3407A/B）
5. Loading buffer（6× ： 36％ glycerol, 0.05％ bromophenol blue, 0.035％ xylene cyanol, 30 mM EDTA）（4．に記載のDNAマーカーには添付されている。）
6. DNA染色剤
   SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain（製品コード 5760A/5761A）またはエチジウムブロマイド

【機器】

1. ヒートブロック（95℃まで温度を上げられるもの）
2. 1.5 mlチューブ対応型冷却遠心機
3. サーマルサイクラー
   TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch（製品コード TP350）
   TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient（製品コード TP600）
4. 電気泳動装置 Mupid-2plus（製品コード M-2P） Mupid-exU（製品コード EXU-1）
5. 電気泳動ゲル撮影装置（SYBR Green Iを使用する場合は、専用のフィルターが必要です。）

【その他】

1. 0.2 ml PCRチューブ
   0.2 ml Hi-Tube Dome Cap（製品コード NJ200）など
2. 200 μl，20 μl，10 μl 各マイクロピペット
3. マイクロピペット用チップ（疎水性フィルター付）

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