SMARTer^®およびSMARTer^® Pico PCR cDNA合成キット

SMART（Switching Mechanism at 5’End of RNA Template）法は、別途アダプターライゲーション反応を行うことなく、1st strand cDNA合成時にcDNAの両末端に既知の配列を組み込むことができるClontech独自の技術である。また、シンプルで効率的なシングルステッププロトコールにより、非常に少量のtotal RNAからも完全長cDNAの合成とその増幅が行える。LCM（laser-capture microdissection）サンプル由来のtotal RNAやフローサイトメトリーで分取した細胞由来のtotal RNAなど、希少なサンプルからのcDNA合成にもSMART法は非常に有用である。

SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit（製品コード 634925、634926）は、SMART PCR cDNA Synthesis Kit（製品コード 634902）のバージョンアップ製品であり、SMARTer Pico PCR cDNA Synthesis Kit（製品コード 634928）は、Super SMART PCR cDNA Synthesis Kit（製品コード 635000）のバージョンアップ製品である。SMARTerキットには、新たに設計されたSMARTer II A Oligoと新しい逆転写酵素 SMARTScribe Reverse Transcriptaseが採用され、従来製品よりもさらに高感度でバックグラウンドの少ないcDNA合成が可能になった。
SMARTer PCR cDNA Synthesis Kitで出発材料として必要なtotal RNA量は2～1,000 ngであり、従来製品（必要量：50～1,000 ng）よりはるかに微量なtotal RNAからも高品質cDNAの合成が可能である。さらに、SMARTer PicoキットではSMARTerキットのプロトコールを改良することで（反応容量を増やしカラム精製を追加）、少量（1 ng）あるいは非常に濃度の低い（20 pg/μl）total RNAからも高品質二本鎖cDNAを合成することができる。（表1）

表1. SMARTerとSMARTer Picoプロトコールの比較^*

SMARTer	SMARTer Pico
2～1,000 ngのtotal RNA 逆転写反応の液量：3.5 μlまで 鋳型total RNA の濃度：＞ 0.6 μg/μl	1～1,000 ng のtotal RNA 逆転写反応の液量：50 μlまで 鋳型total RNAの濃度：＞ 20 pg/μl
SMARTer first-strand cDNA 合成 液量= 50 μl	SMARTer Pico first-strand cDNA 合成 液量= 106 μl
TE バッファーによる希釈 液量= 50 μl	Nucleo Spin Column による精製 カラム溶出液の量= 80 μl
10 μlのcDNAをSMARTer PCR増幅に使用 100 μl反応 サイクル数の最適化およびスケールアップ	80 μlのcDNAをSMARTer Pico PCR 増幅に使用 100 μl反応 サイクル数の最適化およびスケールアップ
NucleoSpin によるPCR 産物の精製	NucleoSpin によるPCR 産物の精製
ds cDNA の収量：1～2 μg	ds cDNA の収量：1～2 μg

* 両者の違いを太字で示す

表2. 各製品に必要なtotal RNA量

製品名	必要なtotal RNA量
SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit	2～1000 ng
SMARTer Pico PCR cDNA Synthesis Kit	1～1000 ng
SMART PCR cDNA Synthesis Kit（従来品）	50～1000 ng
Super SMART PCR cDNA Synthesis Kit（従来品）	2～1000 ng

SMARTerおよびSMARTer Pico PCR cDNA Synthesis Kitを使用すると、さまざまな用途で利用可能な高品質のcDNAを合成することができる。
・Clontech PCR-Select cDNAサブトラクション
本法は発現量に差がある遺伝子の特定に極めて有用な方法であり、出発材料が少量の場合でも利用可能である。SMARTer PCR cDNA Synthesis Kitで合成したcDNAは、Clontech PCR-Select cDNA Subtraction に直接使用することができる。
・バーチャルノーザンブロットの作製
標準的なノーザンブロットを行うために十分なpoly A⁺ RNAやtotal RNAがない場合には、SMARTer cDNAを用いてバーチャルノーザンブロットを作製することができる。
・ライブラリー構築やPCRによる遺伝子増幅
本キットで合成したcDNAを用いて、任意のベクターでライブラリー構築が可能である。Sfi I制限酵素サイトを利用した簡便かつ定方向でのcDNAライブラリー構築には、SMART cDNA Library Construction Kit（製品コード 634901）が最適である。既知配列を利用して、直接遺伝子増幅を行うこともできる。3’配列あるいは5’配列が未知の場合には、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（製品コード 634923、634924）の使用をお勧めする。

SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit
（製品コード 634925、634926）
・SMARTer II A Oligonucleotide (12 μM)
・Control Total RNA
・3’SMART CDS Primer II A (12 μM)
・5× First-Strand Buffer (RNase-Free)
・5’PCR Primer II A (12 μM)
・dNTP Mix (10 mM of each dNTP)
・DTT
・Deionized H₂O
・SMARTScribe Reverse Transcriptase
・RNase Inhibitor
・CHROMA SPIN-1000+DEPC-H₂O Columns

SMARTer Pico PCR cDNA Synthesis Kit
（製品コード 634928）
・SMARTer II A Oligonucleotide (12 μM)
・Control Total RNA
・3’SMART CDS Primer II A (12 μM)
・5’PCR Primer II A (12 μM)
・5× First-Strand Buffer (RNase-Free)
・dNTP Mix (10 mM of each dNTP)
・RNase Inhibitor
・SMARTScribe Reverse Transcriptase
・Deionized H₂O
・NucleoSpin Gel and PCR Clean-up

注：別途、PCR酵素が必要です。ユーザーマニュアルでは、Advantage 2 PCR Kit（製品コード 639207）を用いたプロトコールを紹介しています。

#634925、634926
　CHROMA SPIN-1000+DEPC-H₂O Columns：室温
　Control RNA, SMARTer II A Oligo：－70℃
　その他のコンポーネント：－20℃
#634928
　NucleoSpin Gel and PCR Clean-up：室温
　Control RNA, SMARTer II A Oligo：－70℃
　その他のコンポーネント：－20℃