SMARTer^® Stranded Total RNA-Seq Kit - Pico Input Mammalian

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit - Pico Input Mammalianは、250 pg～10 ngの哺乳類total RNAからイルミナ社シーケンサー用ライブラリーを迅速に作製するキットである。本キットは、FFPEやLCMサンプルから調製された、分解の進んだ低品質RNAも使用できる。インデックスとアダプターを付加したstrand-specific RNA-seqライブラリーを、一連の操作により約5時間で作製できる。
total RNA中に含まれるリボソームRNA（rRNA）（および一部ミトコンドリアRNA）は、rRNA特異的プローブを使用したリボソームcDNAを除く独自技術を採用することにより、効率的に除かれる。その結果、シーケンスコストを下げ、マッピング精度（mapping statistics）を上げることができる。
96回用（製品コード 635007）の製品には12種類のReverseプライマーと8種類のForwardプライマーが含まれており、ハイスループット解析用に最大96インデックスが設定できる。

＊RNAサンプル量が、10 ng以上の場合は以下の製品のご使用をお勧めします。
・10～100 ng total RNAの場合：
　　　SMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit - Low Input Mammalian（製品コード 634861）
・100 ng～1 μg total RNAの場合：
　　　SMARTer Stranded Total RNA Sample Prep Kit - HI Mammalian（製品コード 634873～634873）

また、本キットにはインデックスプライマーが含まれているが、インデックスホッピング低減のためのユニークデュアルインデックスキット（別売）も使用可能である。

図1．実験フローチャート


図2．各ヒト組織のエキソンマッピングと転写産物同定
250 pg total RNAから、R-Probesの＋／－で作製されたライブラリーのリード数分布を示す。各ライブラリーは、106ペアエンドリードに対応するシーケンスが解析された。


図3．ラットとマウス組織のエキソンマッピングと転写産物同定
250 pg または500 pg total RNAから、R-Probesの＋／－で作製されたライブラリーのリード数分布を示す。各ライブラリーは、106ペアエンドリードに対応するシーケンスが解析された。


図4．リボソームcDNA除去のライブラリーへの影響
250 pg ヒト脳total RNAまたは心臓total RNAからリボソームcDNA除去処理＋／－（R-Probesの＋／－）で作製された各ライブラリーのFPKMs(Fragments Per Kilobase Of Exon Per Million Fragments Mapped)の相関性を調べた


図5．分解されたRNAの解析例
RIN値8の250 pgヒトtotal RNAは4分間のFragmentation処理を行い、分解の進んだRIN値2.5の250 pgヒトtotal RNAはそのまま本キットによりライブラリー作製を行った。
イルミナ社MiSeqによりシーケンス後、インサートサイズごとの分布を示す。


図6．使用RNA量間での高再現性
250 pgおよび10 ngマウス脳total RNAから作製された各ライブラリーのFPKMs（Fragments Per Kilobase Of Exon Per Million Fragments Mapped）の相関性を調べた。

Package 1:
　　　TSO Mix
　　　R-Probes
　　　ZapR
　　　Control Total RNA (1 μg/μl、mouse brain)

Package 2：
　　　SMART Pico Oligos Mix
　　　5X First-Strand Buffer
　　　SMARTScribe RT (100 U/μl)
　　　RNase Inhibitor (40 U/μl)
　　　10X ZapR Buffer
　　　Stranded Elution Buffer
　　　PCR2 Primers
　　　Nuclease-Free Water
　　　SeqAmp DNA Polymerase
　　　SeqAmp PCR Buffer (2X)

Indexing Primer Set:
　　　12回用（製品コード 635005）
　　　Indexing Primer Set HT for Illumina-12
　　　Forward PCR Primer HT Index 2 (F2; 12 μM)
　　　Reverse PCR Primer HT Index 1～12 (R1～R12; 12 μM)

　　　48回用（製品コード 635006）
　　　Indexing Primer Set HT for Illumina - 48 A
　　　Forward PCR Primer HT Index 1～4 (F1～4; 12 μM)
　　　Reverse PCR Primer HT Index 1～12 (R1～R12; 12 μM)

　　　96回用（製品コード 635007）
　　　Indexing Primer Set HT for Illumina
　　　Forward PCR Primer HT Index 1～8 (F1～8; 12 μM)
　　　Reverse PCR Primer HT Index 1～12 (R1～R12; 12 μM)

Package 1：－70℃
Package 2：－20℃
Indexing Primer Set：－20℃

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

• シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl
• 8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
• First-Strand cDNA 合成専用のPCRサーマルサイクラー
• Double-Strand cDNA 増幅専用のPCRサーマルサイクラー
• フィルターピペットチップ： 10 μl、20 μlおよび200 μl
• 0.2 ml tube minicentrifuge
• 96-well PCR chiller rack: IsoFreeze PCR Rack (MIDSCI, Cat. No. 5640-T4) or 96 Well Aluminum Block (Light Labs, Cat. No. A-7079)

PCR増幅およびバリデーション

• Qubit dsDNA HS kit (Life Technologies, Cat. No. Q32851)
• Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Code 1402-4700）
• Nuclease-free nonsticky 1.5 ml tubes (USA Scientific社 Code 1415-2600)

SPRI Bead精製

• Agencourt AMPure XP PCR Purification Kit（5 ml; Beckman Coulter社; 5 ml, Code. A63880、60 ml, Code. A63881）
• 0.2 ml チューブ用Magnetic Separation Device
• 80％ Ethanol（用時調製）