SMARTer^® Human TCR a/b Profiling Kit

SMARTer Human TCR a/b Profiling Kitは、イルミナ社次世代シーケンサーを用いたヒトT細胞受容体（TCR）のレパトア解析用ライブラリー作製キットである。ヒト末梢血由来total RNA（10 ng～3 μg ）、あるいはインタクトなリンパ球（精製済みT細胞 50～10,000個）から直接ライブラリーが作製でき、5’RACE法の応用によってTCR mRNAの完全長V(D)J 可変領域の配列を得ることができる。TCRα鎖とTCRβ鎖のレパトアデータの取得を同一ライブラリーで、あるいは個別にライブラリーを作製して実施することが可能である。
マルチプレックスPCRによる方法とは異なり、本キットではTCRα鎖、β鎖、それぞれに対して単一のプライマーを用いた2段階のPCRでライブラリー増幅を行っている。
また、本製品はSMARTテクノロジー（Switching Mechanism at 5’End of RNA Template）とLNAテクノロジーを利用しており、高感度でバイアスの少ないレパトア解析が可能となっている。
作製されたライブラリーにはインデックスが付加されており、そのままイルミナ社次世代シーケンサーに用いてレパトア解析ができる。

図1. SMARTer Human TCR a/b Profiling Kitを用いたライブラリー作製の概要

SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit Components

Package 1

・Control RNA (1 μg/μl)

Package 2

・SMART-Seq v4 Oligonucleotide (48 μM)

・TCR dT Primer (12 μM)

・5X Ultra Low First-Strand Buffer

・SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)

・Nuclease-Free Water

・RNase Inhibitor (40 U/μl)

・10X Lysis Buffer

・Elution Buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.5)

・TCRa Human Primer 1 (12 μM)

・TCRb Human Primer 1 (12 μM)

・SMART Primer 1 (12 μM)

SeqAmp DNA Polymerase（製品コード 638509）

・SeqAmp DNA Polymerase

・SeqAmp PCR Buffer (2X)

TCR a/b Human Indexing Primer Set HT for Illumina

TCR a/b Human Indexing Primer Set HT for Illumina-96

・TCRa Human Primer 2 Reverse HT Index 1～8(aR1～aR8; 12.5 μM)

・TCRb Human Primer 2 Reverse HT Index 1～8 (bR1～bR8; 12.5 μM)

・TCR Primer 2 Forward HT Index 1～12 (F1～F12; 12.5 μM)

・・・ 96回用（製品コード 635016）に添付

SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit Components
　　Package 1：－70℃
　　Package 2：－20℃
　　　10X Lysis Buffer は融解後4℃保存
　　　Elution Bufferは融解後室温保存
SeqAmp DNA Polymerase：－20℃
TCR a/b Human Indexing Primer Set HT for Illumina：－20℃

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

PCR増幅およびバリデーション：
・First-Strand cDNA 合成専用のPCRサーマルサイクラー
・Double-Strand cDNA 増幅専用のPCRサーマルサイクラー
・High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit（Advanced Analytical社 Code DNF-474）
・DNA 1000 Kit（Agilent社 Code 5067-1504）
・ Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml；USA Scientific社 Code 1402-4700）
・Nuclease-free low adhesion 1.5 ml tube（USA Scientific社 Code 1415-2600）またはLoBind tube（Eppendorf社 Code.022431021）

SPRI Bead精製：
・Agencourt AMPure PCR Purification Kit（5 ml Beckman Coulter社 Code A63880、60 ml Beckman Coulter社 Code A63881）－増幅cDNAの精製に使用する
・Small volume用Magnetic stand
・100％ Ethanol
その他
・シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl
・8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
・フィルターピペットチップ： 2 μl、20 μlおよび200 μl
・1.5 ml tube用minicentrifuge
・0.2 ml tubeまたはstrip用minicentrifuge