in vitro Transcription T7 Kit (for siRNA Synthesis)

本製品は、T7 RNA Polymeraseを用いたin vitro transcription反応により、大量の一本鎖RNAを合成するためのキットである。T7 RNA Polymeraseは、T7プロモーター配列を含む二本鎖DNAを鋳型としてプロモーター下流の配列を転写し、効率よく一本鎖RNAを合成する。例えば、20 ngのControl Template（直鎖状プラスミドDNA）を鋳型として約2 kbのRNAを合成する場合、20 μlの反応系で通常10 μg程度のRNAが得られる。T7プロモーター配列を持つプラスミドを直鎖状にして鋳型として利用できるほか、T7プロモーター配列を付加したPCR産物や合成DNAも鋳型として用いることができる。
また、本製品にはRNase T1が含まれており、in vitro transcription反応によりsiRNAの作製を行うこともできる。本キットを用いてsiRNAを作製するには、まず、T7プロモーター配列を付加したsiRNA配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド（センス鎖用とアンチセンス鎖用の2組）を用いてin vitro transcription反応を行い、一本の反応チューブ中でセンス、アンチセンスのそれぞれのRNAを同時に合成する。反応終了時にセンス鎖とアンチセンス鎖は反応液中でアニーリングしている。次に、RNase free DNase Iによる鋳型の除去およびRNase T1による処理を行った後、siRNAを精製し、RNAi実験に使用する。

（20 μl反応、50回分）

10×Transcription Buffer		100 μl
T7 RNA Polymerase	50 U/μl	100 μl
RNase Inhibitor	40 U/μl	25 μl
ATP Solution	50 mM	100 μl
GTP Solution	50 mM	100 μl
CTP Solution	50 mM	100 μl
UTP Solution	50 mM	100 μl
RNase free DNase I	5 U/μl	200 μl
Control Template	50 ng/μl	20 μl
RNase T1	100 U/μl	25 μl
RNase T1 Dilution Buffer		700 μl
RNase Free dH2O		1 ml
10×Annealing Buffer*		500 μl

* siRNA作製のための2本のオリゴヌクレオチドをアニーリングする際に使用する。
（組成；100 mM Tris-HCl (pH8.0)、500 mM CH₃COOK、10 mM EDTA）

－20℃

1） T7プロモーター配列を付加したsiRNA配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを2組作製する。

2） 作製した2組の二本鎖オリゴヌクレオチドを鋳型として一本のチューブ内でin vitro transcription反応を行い、センス、アンチセンスそれぞれのRNAを同時に合成する。合成されたRNAは二本鎖を形成する。

3） DNase Iによる鋳型オリゴヌクレオチドの除去およびRNase T1による一本鎖RNA部分（GGG）の分解を行う。

4） 3'末端2塩基が突出したsiRNAを精製、回収する。