iDimerize™ Reverse Dimerization System

iDimerize Reverse Dimerization Systemは低分子化合物の培地への添加により、タンパク質複合体の解離をリアルタイムで制御できる、発現ベクターと低分子化合物を含むシステムである。目的タンパク質をDmrDドメインと融合・発現させると、D/D Solubilizerリガンドが存在しないと融合タンパク質は凝集する。

iDimerize Reverse Dimerization Systemは“reverse dimerization”、凝集状態にあるタンパク質分子を、D/D Solubilizerの添加により解離させるシステムである。
したがって、iDimerize Reverse Dimerization Systemは他のiDimerizeシステムとは補完関係にあり、誘導的ダイマー化の作製にも使用できる。本キットでは、オリゴマー化により活性化された反応過程を停止することで、iDimerizerシステムでコントロールできる、ほとんどの反応を“逆に”制御することができる。

タンパク質の大きな凝集体を利用した、ユニークな応用例として、融合タンパク質に分泌シグナル配列を付加すると、小胞体で凝集体を形成する。リガンドが添加されると、細胞からタンパク質の迅速な分泌が誘導される。この方法は、迅速、一過性かつ厳密に制御されたヒト成長ホルモン(hGH)とインシュリンの分泌を誘導するために用いられた。(Rivera, V. M., et al. (2000) Science 287(5454):826–830)

D/D Solubilizerは細胞膜透過性リガンドであり、DmrDドメインを含む融合タンパク質のダイマー化を解離することができる。D/D Solubilizerはin vitroやマウスで毒性試験されており、毒性がないことが示されている。容量依存的なデータを取得するためには、Solubilizerを推奨範囲内の濃度(10～500 nM)および時間（30分から12時間以上）でテストすることを推奨する。なお、D/D SolubilizerはARIAD Pharmaceuticals Inc.から発売していたAP21998リガンドとは異なる分子であるが、同様の機能を有しており、このキットのリガンドとして使用できることが確認されている。

Reverse Dimerization Systemはタンパク質の凝集を誘導する結合モチーフ（紫）を発現するベクターとタンパク質を解離（可溶化）するSolubilizer （黄色）を含む。このシステムにより、細胞内輸送の研究や調節性分泌の誘導が可能である。

タンパク質の誘導分泌
DmrDドメインを含む融合タンパク質は、大きな凝集体として小胞体に局在している（左）。
D/D Solubilizerが添加されると凝集体は解離し、分泌装置を通してタンパク質が輸送される（右）。タンパク質が分泌されるかを確かめるため、フューリン切断配列をDmrDドメインと目的タンパク質の間に配置した。
フューリン酵素はトランス･ゴルジ体で特異的に発現するため、融合タンパク質はその場所を横切る際に処理され、正しく処理されたタンパク質は分泌される。この手法は、迅速、一過性かつ密接に制御されたヒト成長ホルモン(hGH)とインシュリンの分泌を誘導するために用いられた。(Rivera, V. M., et al. (2000) Science 287(5454):826–830).

D/D Solubilizerの添加によるDmrD融合ルシフェラーゼの分泌
DmrD融合Metridia分泌型ルシフェラーゼ発現ベクターを細胞に導入し、7時間後に6ウェルプレートに分けた。その後、培地を除去し、異なる濃度のD/D Solubilizerを含む培地に交換して、培養した。培養開始から18時間後にReady-To-Glow Secreted Luciferase Reporter System（製品コード 631731）を用いてルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した。D/D Solubilizerの添加濃度が、50 nMを超えた頃から、ルシフェラーゼの分泌が開始されていることが確認できる。

D/D Solubilizer.の化学構造式
D/D SolubilizerはAP21998 リガンドと異なる分子であるが、同じ機能を示す。

iDimerize Reverse Dimerization System（製品コード 635066）
・prHom-1 Vector
・prHom-Nuc1 Vector
・prHom-Sec1 Vector
・Linear Hygromycin Marker（製品コード 631625）
・Linear Puromycin Marker（製品コード 631626）
・D/D Solubilizer（製品コード 635054）