SMARTer^® Ultra^® Low Input RNA Kit for Sequencing - v3

SMARTer Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing - v3は、非常に少量の細胞やtotal RNAからのトランスクリプトーム解析（RNA-Seq）用のライブラリー作製に有用なcDNA調製キットである。本製品は、わずか1～1,000個の細胞、またはごく微量のtotal RNA（10 pg～10 ng）からのcDNA調製に適している。従来製品と比較して、GC含量の高い遺伝子も効率よく増幅できるため、より多くの遺伝子について網羅的にマッピングできる。増幅されたcDNAは、イルミナ社のNextera sample preparation kitを用いてライブラリー作製しイルミナ社シーケンサーで解析できる。また、Ion Xpress Plus Fragment Library Kit（Life Technologies）でライブラリーを作製し、Ion Torrentシーケンサーで解析できる。

本製品はoligo dTプライマーを利用しており、分解が少なく高品質のRNA（RIN＞8）、または損傷のないインタクトな細胞をサンプルとして使用する。

SMART（Switching Mechanism At 5’End of RNA Template）技術は、遺伝子の全長をカバーでき、遺伝子の全長解析、スプライスジャンクション解析、細胞中でのスプライシング現象の解析など、トランスクリプトーム解析において威力を発揮する優れた技術である。


表1．従来製品とのシーケンス結果比較
本製品（UL-v3）と従来製品SMARTer Ultra Low Input RNA Kit for Illumina Sequencing (UL-HV)から得られたシーケンス結果を比較した。cDNAライブラリーは、100 pgヒト脳total RNA (HBR)または10 pgマウス脳total RNA (MBR)から作製された。シーケンスは、イルミナ社MiSeqシステムを使用した。10 pgサンプルにおいて、本製品で得られるデータが顕著に改善されていた。


図1．1細胞または1,000細胞からのcDNA増幅
HeLa細胞（図A）およびJurkat細胞（図B）の1細胞または1,000細胞からSMARTer Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing - v3を用いてcDNAを調製した。
得られたcDNAをAgilent 2100バイオアナライザーにより解析した結果、単一メインピークが得られた。（HeLa細胞での1 kbまでのピークは高発現しているFTH1遺伝子由来である）


図2．シーケンス結果比較
SMARTer Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing - v3（UL-v3）または、SMARTer Ultra Low Input RNA Kit for Illumina Sequencing-HV（UL-HV）を使用し、100 pgヒト脳total RNAからライブラリーを作製後、シーケンスを行った。遺伝子をGC含量ごとに分類し、各キットのデータ比較を行った。各キット（図A、B）とも再現性の良いデータが得られた。UL-v3とUL-HVを比較すると（図C）、高GC含量の遺伝子（赤色）では、UL-v3キットの方がより高い発現を示した。一方、GC含量が中程度（灰色）または低い（青色）遺伝子では、両キットで同程度の発現レベルを示した。


図3．インプットRNA量と転写産物領域分布
X軸は、各遺伝子長を100％として表し、数値0は遺伝子転写産物の5’端を、数値100は3’端を示している。Y軸は、遺伝子の平均転写産物のカバー率を示す。本キットにより作製されたcDNAライブラリーでは、使用RNA量に関らず、遺伝子のほぼ全領域をカバーしている。


表2．各次世代シーケンサーで得られたデータ
1細胞または1,000細胞のHeLa細胞またはJurkat細胞から本キットにより作製されたcDNAライブラリーを、MiSeqシステム（イルミナ社）（A）またはIon Torrentシステム（Life Technologies）（B）の解析結果を示す。

BOX1
　　SMARTer II A Oligonucleotide（12 μM）
　　Control Total RNA（1 μg/μl）
BOX2
　　3' SMART CDS Primer II A（12 μM）
　　Primer II A - v3（12 μM）
　　5X First-Strand Buffer
　　SMARTer dNTP Mix (20 mM each)
　　Dithiothreitol (DTT；100 mM)
　　SMARTScribe Reverse Transcriptase（100 U/μl）
　　Nuclease-Free Water
　　RNase Inhibitor（40 U/μl）
　　10X Lysis Buffer - v3
　　Elution Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.5)
　　10X Afa I Buffer
　　0.1% BSA
　　Afa I（10 U/μl）
SeqAmp DNA Polymerase（製品コード 638504）
　　SeqAmp DNA Polymerase
　　SeqAmp PCR Buffer（2×）

Control Total RNA、SMARTer IIA Oligonucleotide： －70℃
10X Lysis Buffer - v3、Elution Buffer： －20℃（融解後は4℃保存）
その他のコンポーネント： －20℃

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。

• シングルチャンネルピペット： 10 μl、20 μlおよび200 μl
• 8連チャンネルピペット： 20 μl、200 μl
• フィルターピペットチップ： 2 μl、20 μlおよび200 μl
• 1.5 ml tube用minicentrifuge
• 0.2 ml tubeまたはstrip用minicentrifuge

PCR増幅およびバリデーション：

• First-Strand cDNA 合成専用のPCRサーマルサイクラー
• High Sensitivity DNA Kit（Agilent社 Code.5067-4626）
• Nuclease-free thin-wall PCR tube（0.2 ml ; USA Scientific社 Code.1402-4700）
• Nuclease-free low adhesion 1.5 ml tube（USA Scientific社Code.1415-2600）またはLoBind tube（Eppendorf社 Code.022431021）

SPRI Bead 精製：

• Agencourt AMPure PCR Purification Kit（5 ml Beckman Coulter社 Code.A63880 ; 60 ml Beckman Coulter社 Code. A63881）
  　　　－増幅cDNAの精製に使用する
• Small volume用Magnetic stand
• 100％ Ethanol

シーケンスライブラリー作製：
使用シーケンスシステムにより必要なものを選択する。

• Ion Xpress Plus Fragment Library Kit（Life Technologies社 Code.4471269）
• Nextera XT DNA Sample Preparation Kit（Illumina社、Code. FC-131-1024, FC-131-1096）
• Covaris社 DNA Shearing装置