SMARTer^® Mouse TCR a/b Profiling Kit

SMARTer Mouse TCR a/b Profiling Kitは、イルミナ社次世代シーケンサーを用いたマウスT細胞受容体（TCR）のレパトア解析用ライブラリー作製キットである。マウスの脾臓、胸腺、末梢血単核細胞由来total RNA(10～500 ng)、あるいは精製済みT細胞1,000～10,000個から直接ライブラリーが作製でき、5’RACE法の応用によってTCR mRNAの完全長V(D)J 可変領域の配列を得ることができる。
TCRα鎖とTCRβ鎖のレパトアデータの取得を同一ライブラリーで、あるいは個別にライブラリーを作製して実施することが可能である。
マルチプレックスPCR法とは異なり、本キットではTCRα鎖、β鎖、それぞれに対して単一のプライマーを用いた2段階のPCRでライブラリー増幅を行っており、プライマーダイマー形成を抑えた高効率な増幅が可能である。
また、マルチプレックスPCRではプライマーに起因する配列特異的なバイアスが避けられないが、本製品は定常（非可変）領域にアニーリングする単一プライマーで全ての可変領域を増幅するため、プライマーに起因するバイアスが少ない。
本製品は5’RACE法を応用したSMARTテクノロジー（Switching Mechanism at 5’End of RNA Template）とLNAテクノロジーの利用により、高感度でバイアスの少ないレパトア解析が可能となっている。
4時間でインデックスを付加したライブラリー作製ができ、そのままイルミナ社次世代シーケンサーに用いてレパトア解析ができる。

図1. SMARTer Mouse TCR a/b Profiling Kitを用いたライブラリー作製の概要




図2. SMARTer Mouse TCR a/b Profiling Kitを用いたマウス脾臓TCRの多様性評価
脾臓全T細胞とCD4^＋T細胞のTCRの多様性を比較することを目的として、脾臓から全脾細胞を分離して２つのグループに分け、1つのグループはそのまま、もう1つのグループはCD4^＋T細胞の精製を行った後、total RNAを抽出して、10 ngを用いてライブラリー調製を行った（パネルA）。
パネルB：TCRα、またはTCRβのCDR3領域にマッピングされたシーケンスリードの割合。約70％のリードがTCRαまたはTCRβにマッピングされ、良好なオンターゲット率を示した。
パネルC：TCRα(左)、TCRβ（右）に同定されたクローンタイプ数とリード数の解析
曲線がフラットになり始めた点を検出されるクローンタイプ数の飽和点とし、リード数が増えた場合の理論上のクローンタイプ数を点線で示した。TCR多様性評価に必要なリード数は、脾全細胞では約100,000リード以上、CD4^＋T細胞では約400,000リード以上であることが示された。



図3. トランスジェニックマウス各組織におけるTCRα 多様性の評価
＜実験概要＞
加齢に伴って大腸炎になるRag-1欠損マウスの各組織からtotal RNAを抽出後、本キットを用いてライブラリーを作製しNGS解析を行った。 16週齢、34週齢、38週齢のマウスの、胸腺（Thymus）、脾臓（Spleen）、末梢リンパ節（Peripheral Lymph Nodes, PLN）、腸間膜リンパ節（Mesenteric Lymph Nodes, MLN）、大腸（Large Intestine, LI）からtotal RNAを抽出後、10 ngを用いてライブラリーを調製した。但し、本実験ではTCRαをメインに検出するため、TCRα、TCRβに対する特異的プライマーの混合比率を1：1ではなく、2：1とした。シーケンスにはMiSeq（2×300 bp）を用いて、1サンプルあたり400,000リードで解析を行い、ソフトウェアはMiXCR（Bolotin et al. 2015）を使用した。
参考文献：Bolotin, D. A. et al. MiXCR: software for comprehensive adaptive immunity profiling. Nat. Methods12, 380–381 (2015).
＜結果＞
パネルA．各組織の各週齢において、シーケンスリードの約60～80％がTCRα CDR3領域にマッピングされ、高いオンターゲット率が得られた。
パネルB．同定されたTCRαクローン型の数は、各週齢のほとんどの組織で多かった一方、大腸（LI）では少ない結果となった。大腸で少なかった理由は、恐らくT細胞の浸潤が低いためと考えられる。
パネルC． TRAV3-2-TRAJ58クローン型の割合は、16週齢、34週齢のマウス胸腺では全体の約0.025％だったが、38週齢では約0.005％となった。一方、腸間膜リンパ節では週齢に関わらず高い割合を示したが、大腸では低い割合となった。このように発現量の少ないクローンでも、すべての組織において感度良く解析できた。
パネルD．38週齢のマウスではTRAV16N-TRAJ56クローン型が、大腸（LI）で非常に多く検出され、このクローンが大腸炎と関わりがあることが示唆された。

SMARTer Mouse TCR a/b Profiling Kit Components
Package 1

Package 2
TCR a/b Mouse Indexing Primer Set HT for Illumina

SMARTer Mouse TCR a/b Profiling Kit Components
　　Package 1：－70℃
　　Package 2：－20℃
　　　10X Lysis Buffer は融解後4℃保存
　　　Elution Bufferは融解後室温保存
　　Package 3：－20℃
TCR a/b Mouse Indexing Primer Set HT for Illumina：－20℃

下記の製品は本キット中に含まれません。下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替はできないため、ご注意ください。


SPRI Bead精製
その他