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Guide-it Long ssDNA Production System v2
CRISPR/Cas9でのノックインはドナーDNAを作製し、主にCas9-sgRNA複合体もしくはCas9-sgRNA発現ベクターと共に導入することで起こる。
ドナーDNAは、二本鎖DNA(dsDNA)より一本鎖DNA(ssDNA)を使用する方が多くの利点があることが近年示されているが、長鎖のssDNAは作製が難しいため使用が制限されていた。
Guide-it Long ssDNA Strandase Kit(製品コード 632645)は、500 basesから5 kbまでの長鎖ssDNAが調製でき、CRISPR/Cas9のノックインドナー用DNAとして使用できる。
本キットには ssDNAを50回(センス鎖、アンチセンス鎖それぞれ25回)作製するために必要な試薬が含まれている。
独自技術のStrandase処理により、PCR産物のセンス鎖またはアンチセンス鎖を選択的に分解し、簡便な方法で最終的にセンス鎖もしくはアンチセンス鎖のssDNAが調製できる。
Guide-it Long ssDNA Production System(製品コード 632644)はGuide-it Long ssDNA Strandase Kit(製品コード 632645)とssDNA精製用のNulceoSpin Gel and PCR Clean-up(製品コード 740609.50)がセットになった製品である。
まず、dsDNAテンプレートをクローニング、fusion PCR、または他の方法により調製する。テンプレートは目的遺伝子の他に、目的遺伝子を挿入する左右の隣接配列と相同のアームを含む必要がある。
次に、dsDNAテンプレートを片側のみリン酸化プライマーを使用してPCRを行い、異なる2種類のdsDNA産物を作製する(これらはそれぞれ、センス鎖ssDNA、アンチセンス鎖ssDNA作製のための鋳型となる)。
Strandase Mix Aを加えてセンス鎖もしくはアンチセンス鎖を分解する。Strandase Mix Aは5’がリン酸化された鎖だけを分解するので、センス鎖側またはアンチセンス鎖側を選択的に分解できる。次にStrandase Mix Bを加えて最終の分解を行い、ssDNAが得られる。
得られたssDNAをクリーンアップし、CRISPR/Cas9でのノックイン実験に使用する。
センス鎖、アンチセンス鎖両方のssDNAを調製し、それぞれ別々にノックイン実験を行うことを推奨する。
AAVSにあるターゲットサイトのホモロジーアーム(600 bp)を含んだEF1αプロモーターおよびAcGFP1を含むssDNAドナーを作製し、ノックイン実験を行った。
GFP陽性クローンを単離した後、挿入されたサイトの正確性を調べるためにシーケンスを行った。その結果、すべてのクローンで目的遺伝子が正しい位置に挿入され、つなぎ目に変異が入っていないことが確認できた。
Panel A: | GAPDHまたはTyr geneへAcGFP1を挿入するための長鎖ssDNAを作製した。 一部のssDNAは、本来あるべきssDNAの長さより多少短くなっていた。 |
Panel B: | CCR5 locus用の2~5 kbまでのssDNAの作製を行った。 |
Panel A: | GAPDHのexon 8領域にGAPDHとインフレームで融合するようにAcGFPを挿入するためのドナーssDNAテンプレートを本キットを使って作製した。 |
Panel B: | HEK293細胞へ変異導入後のフローサイトメトリーの結果を示した。 |
hiPSC18の、tubulin領域にAcGFP1をノックインするssDNA、もしくはdsDNAをCas9と一緒に、をエレクトロポレーションで導入した。Cas9を加えない場合も同時に行った。
ドナーテンプレートは、インサートの両側に350 bの相同アームを持つ構造で長さは約1.5 kbである。dsDNAドナーを用いた場合は、Cas9存在下・非存在下どちらにおいても顕著な毒性が見られた。
PrimeSTAR Max Premix (2X) | 625 μl×4 |
Strandase Mix A | 250 μl |
Strandase A Buffer (10X) | 250 μl |
Strandase Mix B | 50 μl |
Strandase B Buffer (2X) | 1.25 ml×2 |
RNase Free Water | 1 ml×5 |
2-kb Control Template (2 ng/μl) | 50 μl |
Control Primer Mix (16 μM) | 50 μl |
Guide-it Long ssDNA Strandase Kit(製品コード 632645) | -20℃ |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(製品コード 740609.50) | 室温 |
【ユーザー様実施例】Guide-it™ Long ssDNA Production Systemを用いたノックインマウスの作製 (マイクロインジェクション法によるマウス受精卵のゲノム編集)
Efficient gene knockins in iPS cells using long ssDNA templates for homology-directed repair
Highly specific gene knockins of long sequences using CRISPR/Cas9 and a single-stranded DNA donor template
オフターゲットを抑制し、in vivoでの効率的なゲノム編集が可能
PCR産物の精製にもDNAのゲル抽出にも対応
in vitro transcriptionによるsgRNAの調製およびsgRNAの有効性の確認
簡単操作で5 kbまでのノックインドナー用一本鎖DNAを効率的に調製可能
ゲノム編集を強力に支えるサポートツール
プラスミドDNA用いるゲノム編集システム