簡単操作で5 kbまでのノックインドナー用一本鎖DNAが調製可能
- CRISPR/Cas9ノックインドナー用長鎖一本鎖DNA（ssDNA）調製キット
- 500 bases～5 kbまでのssDNAが調製可能
- 独自技術の「Strandase処理」で二本鎖を一本鎖化
- クローニング操作、ゲル抜き精製不要の簡単プロトコール
- 二本鎖DNAに比べてランダムインテグレーションが少ないため、ゲノム編集効率がUp
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Guide-it Long ssDNA Production System v2
製品説明
CRISPR/Cas9でのノックインはドナーDNAを作製し、主にCas9-sgRNA複合体もしくはCas9-sgRNA発現ベクターと共に導入することで起こる。
ドナーDNAは、二本鎖DNA（dsDNA）より一本鎖DNA（ssDNA）を使用する方が多くの利点があることが近年示されているが、長鎖のssDNAは作製が難しいため使用が制限されていた。
Guide-it Long ssDNA Strandase Kit（製品コード 632645）は、500 basesから5 kbまでの長鎖ssDNAが調製でき、CRISPR/Cas9のノックインドナー用DNAとして使用できる。
本キットには ssDNAを50回（センス鎖、アンチセンス鎖それぞれ25回）作製するために必要な試薬が含まれている。
独自技術のStrandase処理により、PCR産物のセンス鎖またはアンチセンス鎖を選択的に分解し、簡便な方法で最終的にセンス鎖もしくはアンチセンス鎖のssDNAが調製できる。
Guide-it Long ssDNA Production System（製品コード 632644）はGuide-it Long ssDNA Strandase Kit（製品コード 632645）とssDNA精製用のNulceoSpin Gel and PCR Clean-up（製品コード 740609.50）がセットになった製品である。
まず、dsDNAテンプレートをクローニング、fusion PCR、または他の方法により調製する。テンプレートは目的遺伝子の他に、目的遺伝子を挿入する左右の隣接配列と相同のアームを含む必要がある。
次に、dsDNAテンプレートを片側のみリン酸化プライマーを使用してPCRを行い、異なる2種類のdsDNA産物を作製する（これらはそれぞれ、センス鎖ssDNA、アンチセンス鎖ssDNA作製のための鋳型となる）。
Strandase Mix Aを加えてセンス鎖もしくはアンチセンス鎖を分解する。Strandase Mix Aは5’がリン酸化された鎖だけを分解するので、センス鎖側またはアンチセンス鎖側を選択的に分解できる。次にStrandase Mix Bを加えて最終の分解を行い、ssDNAが得られる。
得られたssDNAをクリーンアップし、CRISPR/Cas9でのノックイン実験に使用する。
センス鎖、アンチセンス鎖両方のssDNAを調製し、それぞれ別々にノックイン実験を行うことを推奨する。
AAVSにあるターゲットサイトのホモロジーアーム（600 bp）を含んだEF1αプロモーターおよびAcGFP1を含むssDNAドナーを作製し、ノックイン実験を行った。
GFP陽性クローンを単離した後、挿入されたサイトの正確性を調べるためにシーケンスを行った。その結果、すべてのクローンで目的遺伝子が正しい位置に挿入され、つなぎ目に変異が入っていないことが確認できた。
Panel A：GAPDHまたはTyr geneへAcGFP1を挿入するための長鎖ssDNAを作製した。
一部のssDNAは、本来あるべきssDNAの長さより多少短くなっていた。
Panel B：CCR5 locus用の2～5 kbまでのssDNAの作製を行った。
一部のssDNAは、本来あるべきssDNAの長さより多少短くなっていた。
Panel A：GAPDHのexon 8領域にGAPDHとインフレームで融合するようにAcGFPを挿入するためのドナーssDNAテンプレートを本キットを使って作製した。
Panel B：HEK293細胞へ変異導入後のフローサイトメトリーの結果を示した。
直鎖状のdsDNAをドナーとして使用した場合は、Cas9とsgRNAの非存在下でも緑色の蛍光が観察された。一方センス、アンチセンス鎖のドナーssDNAテンプレートを使用した場合は、テンプレートがCas9とsgRNAが共に導入された場合のみ、蛍光が観察され、Cas9とsgRNA非存在下では、ほとんど蛍光は観察されなかった。
hiPSC18の、tubulin領域にAcGFP1をノックインするssDNA、もしくはdsDNAをCas9と一緒に、をエレクトロポレーションで導入した。Cas9を加えない場合も同時に行った。
ドナーテンプレートは、インサートの両側に350 bの相同アームを持つ構造で長さは約1.5 kbである。dsDNAドナーを用いた場合は、Cas9存在下・非存在下どちらにおいても顕著な毒性が見られた。
内容
Guide-it Long ssDNA Production System（製品コード 632644）
- Guide-it Long ssDNA Strandase Kit（製品コード 632645）
PrimeSTAR Max Premix (2X) 625 μl×4 Strandase Mix A 250 μl Strandase A Buffer (10X) 250 μl Strandase Mix B 50 μl Strandase B Buffer (2X) 1.25 ml×2 RNase Free Water 1 ml×5 2-kb Control Template (2 ng/μl) 50 μl Control Primer Mix (16 μM) 50 μl - NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up（製品コード 740609.50） 50回×2
保存
| Guide-it Long ssDNA Strandase Kit（製品コード 632645） | －20℃ |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up（製品コード 740609.50） | 室温 |
本製品以外に必要な試薬（主なもの）
ターゲット増幅用プライマー
（5’リン酸化プライマー 2種類、通常のプライマー 2種類 計4種類必要）
（5’リン酸化プライマー 2種類、通常のプライマー 2種類 計4種類必要）
Application
【ユーザー様実施例】Guide-it™ Long ssDNA Production Systemを用いたノックインマウスの作製 （マイクロインジェクション法によるマウス受精卵のゲノム編集）
Technical Notes
Efficient gene knockins in iPS cells using long ssDNA templates for homology-directed repair
Highly specific gene knockins of long sequences using CRISPR/Cas9 and a single-stranded DNA donor template
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