製品説明
本製品は、RT-PCRによりノロウイルスのRdRp領域の一部とVP1領域の一部を含む遺伝子領域を増幅するための試薬、およびPCRにより得られた増幅産物のシーケンスのためのプライマーから成るキットである。
本製品を使用して得られた増幅産物に対して塩基配列解析を行い、得られた塩基配列とデータベース上の配列との相同性検索により、ノロウイルスの遺伝子型判別を行う。
本キットのプライマーを用いることで、「病原体検出マニュアル ノロウイルス(第1版)」(国立感染症研究所(令和元年6月))と同様の領域を解析できる(Dual typing法に対応)。
- 病原体検出マニュアルに収載されたDual typing法に対応
本キットのプライマーを用いることで、「※病原体検出マニュアル ノロウイルス(第1版)」(国立感染症研究所(令和元年6月))と同様の領域を解析できます。
Dual typing法
▶ RdRp(RNA-dependent RNA polymerase)領域の一部とcapsid領域の一部(
VP1)の両方の遺伝子型をタイピング可能な手法。
◆ RdRp領域とVP1領域の間(ジャンクション領域)では
ゲノムの組換えが頻発する。
◆ この組み換えがウイルスの流行に影響することが示唆されている(GII.2[P16]等)。
⇒VP1領域だけでなく、キメラウイルスも確認出来るRdRp領域を含めたタイピングが必要
- ワンステップRT-PCRで操作が簡便
上記Dual typing法は、同病原体マニュアルで2 step RT-PCR法が示されていますが、本キットではワンステップRT-PCR法により、cDNA合成とPCR増幅が同一チューブ内で完了します。
- オールインワン・キットなので、すぐに使用可能
PCR増幅に必要な試薬とシーケンス用プライマーをセットにしており、すぐにご利用いただけます。
内容
Norovirus(GI) RT-PCR Kit for genotyping(製品コード RC120A)
Norovirus(GII) RT-PCR Kit for genotyping(製品コード RC121A)
*1:基質等を含みます。
*2:酵素等を含みます。
*3:GI Primer Mix (NV) に含まれるプライマーは、Sequencing Primer F1 (NV)およびSequencing Primer R1 (NV)と同じ配列です。
*4:GII Primer Mix (NV) に含まれるプライマーは、Sequencing Primer F2 (NV)および Sequencing Primer R2 (NV)と同じ配列です。
保存
-20℃
キット以外に必要なもの(主なもの)
- 【試薬】
-
- RNA抽出キット*1
- アガロースゲル
Agarose L03「TAKARA」(製品コード 5003/B)
PrimeGel Agarose PCR-Sieve(製品コード 5810A)など
- DNA染色剤
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(製品コード 5760A/5761A)*2
エチジウムブロマイド
- 100 bp DNA Ladder (Dye Plus)(製品コード 3422A)
- PCR産物精製キット
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(製品コード 740609.10/.50/.250)など
*1:詳細は上記「病原体検出マニュアル」をご参照ください。
*2:SYBR Green Iを使用する場合は専用のフィルターが必要です。
- 【器具】
-
- 200 μl、20 μl、10 μl 各マイクロピペット
- マイクロピペット用チップ(疎水性フィルター付)
- アガロースゲル電気泳動装置
Mupid-2plus(製品コード M-2P)など
- 0.2 ml Hi-Tube Dome Cap(製品コード NJ200)
- 0.2 ml Hi-8-Tube(製品コード NJ300)
- 0.2 ml Hi-8-Dome Cap(製品コード NJ301)
- 0.2 ml Hi-8-Flat Cap(製品コード NJ302)
- T-100用純正8連チューブ(Bio-Rad社)など
- 【機器】
-
- 微量高速遠心機
- サーマルサイクラー
Thermal Cycler Dice Gradient(製品コード TP600)
Thermal Cycler Dice Touch(製品コード TP350)
T-100 Thermal Cycler(Bio-Rad社)
PCR増幅産物のシーケンス解析について
キットに含まれるSequencing Primer F1/2 (NV)を使用して、得られた精製増幅産物のシーケンス解析(片鎖解析)を行う。必要に応じて、Sequencing Primer R1/2 (NV)も使用し両鎖解析を行うと、精度の高いシーケンスデータが得られる。
※ シーケンス解析には、タカラバイオ受託サービス「
プレミックスシーケンス解析」のご利用をお勧めします。
[プレミックスシーケンス解析にご依頼いただく場合]
以下の混合物を準備後、1つのウェルに分注する。
| 使用量 |
精製増幅産物 | 10~120 ng |
Sequencing Primer F1/2 or R1/2 (NV) (7.5 pmol/μl) | 1 μl |
H2O | x μl |
Total | 15 μl |
- 精製増幅産物を1反応につき10~120 ngご用意ください。(1サンプルについて最大2反応となりますので、最大20~240 ngの精製増幅産物が必要となります。)
- 1つの反応ウェルについて1つのSequencing Primer (7.5 pmol/μl)を1 μl加え、全量を15 μl/ウェルとなるように調製いただき、ご送付ください。
詳細は「プレミックスシーケンス解析(8連チューブ/96ウェルプレート)」をご参照ください。
※「プレート単位シーケンス解析」をご利用される場合は
こちらをご覧ください。
※ご自身でシーケンスを実施することも可能です。その場合、キットのシーケンス用プライマーは7.5 pmol/μlとなっていますので、適宜使用量を調整してご使用ください。
塩基配列情報の解析