SMART-Seq Total RNA Single Cell (ZapR Mammalian)は、1~1,000個のインタクトな細胞または10 pg~10 ngのtotal RNAからイルミナ社次世代シーケンサー対応のライブラリー調製ができるキットで、シングルセルから高感度に再現性の高いデータが取得できるようにデザインされています。本キットは、SMART(Switching Mechanism at 5’ End of RNA Template)テクノロジーを用いており、逆転写およびPCR増幅ステップでインデックスとアダプターを組み込むシームレスなワークフローによって、7時間以内に方向性情報を保持したライブラリーが調製できます。また、ランダムプライマーを用いてcDNA合成を行うため、polyAの有無に関わらず全てのトランスクリプトをキャプチャーでき、分解の進んだ低品質RNAでも使用可能です。さらに、本キットのワークフローにはrRNA特異的プローブを使用した独自技術によってrRNA(および一部ミトコンドリアRNA)由来のcDNAを除去する工程が含まれているため、別途リボゾームRNA除去試薬を用意する必要はなく、rRNAへのマッピングが低い再現性の高いデータが得られます。既存製品と比べてrRNA除去試薬の性能が向上しているため、より高精度の解析が行えます(図5)。
別売りの
Unique Dual Index Kit(製品コード 634752~634756)と組み合わせることにより、最大384サンプルのマルチプレックス解析に対応可能です。
図1.実験フローチャート
図2.SMART-Seq Total RNA Single Cell (ZapR Mammalian)を用いて調製された最終ライブラリーの構造
Unique Dual Index Kit(製品コード 634752~634756)を用いて付加された配列には、イルミナ社シーケンサーのフローセルでクラスタリングできる配列(P7、P5、Index 1 [i7]、Index 2 [i5])と、シーケンスプライマーRead 2およびRead 1を認識する領域が含まれている。Read 1では元のRNAのアンチセンス側の配列が得られ、Read 2では元のRNAのセンス側の配列が得られる。Read 2の最初の3塩基(XXX)はSMART Adapter由来の配列となるため、paired-end sequencingを行った場合、この3塩基はマッピングの前にトリミングする必要がある。
A
B
図3.異なるRNAインプット量から調製したライブラリーのrRNA由来cDNA除去効果
本製品に含まれるSMART-Seq Total RNA Single Cellを用いて10 pgおよび10 ngのヒト脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理(ZapR treatment)を実施したものと実施しないもので比較した。ZapR treatmentしたものはPCR増幅による濃縮後、ZapR treatmentしないものはそのままシーケンスに使用した。それぞれのライブラリーについて、2×10
6ペアエンドリードをCogentAPで解析し、その結果を棒グラフ(パネル A)と表(パネル B)に示した。10 pg、10 ngのいずれのインプット量でも、ZapR trearment処理後のrRNA readsの割合は5%以下となっており、幅広いレンジでrRNA由来cDNAが効率よく除去されることが示された。
A
B
図4.異なるRNAインプット量から調製したライブラリーの遺伝子数とトランスクリプト数の評価
SMART-Seq Total RNA Single Cellを用いて10 pgおよび10 ngのヒト脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理(ZapR treatment)を実施したものと実施しないもので比較した。ZapR treatmentしたものはPCR増幅による濃縮後、ZapR treatmentしないものはそのままシーケンスに使用した。それぞれのライブラリーについて、2×10
6ペアエンドリードをCogentAPで解析し、得られた遺伝子数(パネル A)、およびトランスクリプト数(パネル B)を示した。ZapR treatmentしたライブラリーでは、遺伝子数、トランスクリプト数が増加しており、キットの有効性が示された。
<参考データ>
本製品に含まれるrRNA除去試薬ZapR Mammalian rRNA Depletion Kitは、SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian)(製品コード 634354:日本発売準備中)に含まれるものと同じ製品です。SMART-Seq Total RNA Pico Input with UMIs (ZapR Mammalian)のアプリケーションデータの一つとして取得されたrRNA除去試薬の新旧比較データを図5として示します。
図5.rRNA除去試薬の新/既存製品比較
SMART-Seq Total RNA Pico Input (with UMIs)(新製品)を用いて、250 ngのヒト脳total RNAからライブラリーを調製後、キットに含まれるZapR Mammalian rRNA Depletion KitによるrRNA由来cDNA除去処理(ZapR treatment)を実施し、PCR増幅により濃縮した。コントロールとしてZapR treatmentしていないライブラリーをそのまま用いた(No depletion)。更に、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian(既存製品)を用いて、250 ngのヒト脳RNAからライブラリーを調製した。
それぞれのライブラリーについて、3×10
6ペアエンドリードをCogentAPで解析し、リード分布を比較した。
ZapR Mammalian rRNA Depletion Kitで処理したライブラリーのリード分布は、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalianで調製したライブラリーと比較したところ、rRNAのリードの割合が減少してExonのリードの割合が増加し、rRNA除去試薬の性能向上が示された。
下記の製品はユーザーマニュアルに記載のProtocolで使用できることが確認されています。他製品では代替できないため、ご注意ください。
Index Kit
Unique Dual Index Kit (1-24)(製品コード 634756)
UDI No, U001-U024
Unique Dual Index Kit (1-96)(製品コード 634752)
UDI No, U001-U096
Unique Dual Index Kit (97-192)(製品コード 634753)
UDI No, U097-U192
Unique Dual Index Kit (193-288)(製品コード 634754)
UDI No, U193-U288
Unique Dual Index Kit (289-384)(製品コード 634755)
UDI No, U289-U384
サンプル調製(セルソーティング)
- 8-tube strips(Thermo Fisher Scientific, Cat. No. AB0264)またはセルソーティングに適したPCR tube strips、96 well plates
- (オプション)BD FACS Pre-Sort Buffer(BD Cat. No. 563503)
- Microplate film(USA Scientific, Cat. No. 2920-0010) for sealing tubes/plates before sorting
- Aluminum single tab foil seal(USA Scientific, Cat. No. 2938-4100)または cap strips(Thermo Fisher Scientific, Cat. No. AB0784/AB0850)for sealing tubes/plates after sorting
- ドライアイス(細胞の凍結用)
- (オプション) SMART-Seq HT Kit Lysis Components(製品コード 634439)または10×Lysis Buffer(製品コード 635013)
- 96-well plate用卓上低速遠心機
cDNA合成、PCR増幅
- PCRサーマルサイクラー 2台(cDNA合成用、PCR増幅用)
- Nuclease-free, PCR-grade, thin-wall PCR strips (0.2 ml PCR 8-tube strip; USA Scientific, Cat. No.1402-4700)または同様のPCR-grade, thin-wall PCR tubes, strips、96-well plates
- Nuclease-free, low-adhesion 1.5 ml tubes(USA Scientific, Cat. No. 1415-2600)、DNA LoBind tubes(Eppendorf, Cat. No. 022431021)または同様の核酸低吸着性チューブ
- Thermo Scientific Adhesive PCR Plate Seals (Thermo Fisher Scientific, Cat. No. AB0558)for 96-well plates or cap strips(Thermo Fisher Scientific, Cat. No. AB0784/AB0850)for 8-tube strips
Beads精製
- NucleoMag NGS Clean-up and Size Select(5 ml size:製品コード 744970.5;50 ml size:製品コード 744970.50;500 ml size:製品コード 744970.500)
※NucleoMagの代わりにAMPure XP PCR purification kit(Beckman Coulter 5 ml size:Cat. No. A63880;60 ml size:Cat. No. A63881)も使用可能
- 80%エタノール(用時調製)
- Magnetic Separation Device
- 24~96サンプルの場合:Magnetic Stand 96(Thermo Fisher Scientific Cat. No. AM10027)、V-bottom plates (500 μl; VWR, Cat. No. 47743-996)、adhesive PCR Plate Seals(Thermo Fisher Scientific, Cat. No. AB0558)と組み合わせて使用
- 1.5 mlチューブ(ライブラリーのプール用)の場合:Magnetic Stand (2 tubes)(製品コード 631964)、8-tube strips (Thermo Fisher Scientific, Cat. No. AB0264)、またはnuclease-free, PCR-grade, thin-wall PCR tubes、strips、96-well plates
cDNA定量、ライブラリー定量(必要に応じて選択)
- High Sensitivity DNA Kit(Agilent Technologies, Cat. No. 5067-4626)、High Sensitivity D5000 ScreenTape (Agilent Technologies, Cat. No. 5067-5592)、または同等の高感度電気泳動法
- Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Cat. No. P11496)または Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Cat. No. Q32851 or Q32854)
- Library Quantification Kit(製品コード 638324)
その他
- シングルチャンネルピペット:10 μl、20 μlおよび200 μl、1,000 μl
- 8連、あるいは12連チャンネルピペット:20 μl、200 μl
- フィルターピペットチップ:2 μl、10 μl、20 μl、200 μl、および1,000 μl
- 1.5 mlチューブ用微量遠心機
- 0.2 mlチューブまたはstrip用微量遠心機
- IsoFreeze PCR Rack(MIDSCI, Cat. No. 5640-T4)または96-Well Aluminum Block(Light Labs, Cat. No. A-7079)等の96-well PCR chiller rack
- VWR CryoCoolers(VWR, Cat. No. 414004-286)等の卓上クーラー