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MethylEasy™ Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit(製品コード ME002)

バイサルファイト処理後のPCRについて
Q1 Control PrimerとControl Sample 2(バイサルファイト処理済DNA)を用いてPCRしても増幅しない。
A1 バイサルファイト処理済DNAを用いて増幅する際は、プルーフリーディング活性をもつPCR酵素(PrimeSTARシリーズなど)ではうまく増幅できません。PCRを行う際は、TaKaRa EpiTaq™ HS (for bisulfite-treated DNA)(製品コード R110A/B)EpiScope MSP Kit(製品コード R100A)をお勧めします。前者はバイサルファイト処理後のDNAを鋳型としてPCR増幅を行う場合に最適なPCR試薬であり、後者はMSP(Methylation-Specigfic PCR)解析用の試薬です。

Q2 Control Sample 2(バイサルファイト処理済DNA)を用いた場合は増幅できるが、キットを用いてControl Sample 1(未処理DNA)をバイサルファイト処理したDNAを用いた場合、増幅しない。
A2 バイサルファイト処理がうまくいっていません。以下の点を確認してください。
3 M NaOHは使用前に調製したものをご使用ください。
Reagent 1とReagent 2を混合した試薬は、混合後、ミネラルオイルを加えて、4℃で暗所で保存し、必ず4週間以内に使用してください。混合した試薬に沈殿が生じたときは、80℃で加熱して完全に溶解してから使用してください。
混合した試薬を反応液に加えるときは、ミネラルオイルを持ちこまないように注意してください。
DNA量が50 ng以下のときは、Reagent 3を加える前にCarrier DNA(salmon sperm DNA)を加えてください。

Q3 Control sample 1(未処理のもの)を本キットを用いてバイサルファイト処理したDNAとControl Primerでは増幅できるが、自分のサンプルをバイサルファイト処理したものと自分のプライマーでは増幅しない。
A3
キットに含まれるControl PrimerはControl Sample以外でもマウス、ヒトのバイサルファイト処理済DNAであれば増幅できるので、サンプルがマウスまたはヒトゲノムDNAの場合は、Control Primerを使用して増幅を確認してください。Control Primerで増幅が出来る場合は、使用しているプライマーの設計に問題がある場合があります。
メチル化していないC(シトシン)はバイサルファイト処理後のDNAではウラシルになりますので、その部分の塩基はPCRによりTになります。バイサルファイト処理後のDNAは、A,T,Gが多くなり、プライマーの特異性が低くなるため、非特異的増幅が生じる場合がありますので、特異性を高めるためにnested PCRを行っていただくこともお勧めします。
サンプルDNAは高純度のものをご使用ください。純度が低いと、バイサルファイト処理がうまくいきません。NucleoSpin Tissueなどのキットを用いてDNA精製を行う、またはサンプルDNAをフェノールクロロホルム処理後エタノール沈殿を行う、または再精製を行ってください。

Q4 バイサルファイト処理後のDNAを鋳型にPCRする場合、増幅可能なサイズは?
A4 本キットを用いて処理したDNAでは、600~900 bpでも増幅が確認されていますが、増幅可能なサイズは遺伝子・プライマーにも依存します。確実に増幅するためにはバイサルファイト処理後のDNAの場合、 300 bp以下の増幅サイズになるようにプライマーを設計することをお勧めします。
Q5 Control Sample 1(未処理DNA)は、バイサルファイト処理しなくてもControl Primerで増幅されますか?
A5 Control Primerは Control Sample 1 がバイサルファイト処理された場合のみ、増幅できるような設計になっていますので、未処理のままでは増幅されません。
Q6 Control Primer はシーケンスプライマーとして使用できますか?
A6 Control Primer3A.および3Bはそれぞれforward, reverseのmix primerになっているので、 シーケンスプライマーとしては使用できません。
キットの試薬について
Q7 Reagent 1にReagent 2を加えて混合して、80℃で15~20分インキュベートするが、キットに含まれるReagent 1のボトルのまま、80℃、15~20分保温しても大丈夫ですか?
A7 キットに含まれるボトルのまま混合して、そのままWater Bathでインキュベートしても問題ありません。Reagent 1とReagent 2を混合した試薬は、混合後、ミネラルオイルを加えて、4℃で暗所で保存し、必ず4週間以内に使用してください。混合した試薬に沈殿が生じたときは、80℃で加熱して完全に溶解してから使用してください。

Q8 本キットでバイサルファイト処理したDNAは保存できますか?
A8 バイサルファイト処理したDNAは、短期間であれば-20℃で、長期間(3ヵ月以上)であれば-80℃で保存してください。-80℃で保存したDNAは、数年間安定です。

Q9 Reagent 5は使用するたびに、温めるのですか?
A9 はい、Reagent 5は、必ず毎回(溶出するたびに)65~70℃に温めてからご使用ください。 Reagent 5は毎回温めても品質には問題ありません。
Q10 Reagent 4はエタノールを加えてからも安定ですか?
A10 はい、Reagent 4は、エタノールを加えてからも安定です。フタを硬くしめて室温で保存してください。

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