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Q1 RenillaGaussiaルシフェラーゼ活性を測定するために、Ready-To-Glowレポーターアッセイを用いることができるか?
A1 できます。しかし、このキットは分泌型Metridiaルシフェラーゼレポーターに最適化されています。また、同一細胞内でのMetridiaルシフェラーゼレポーターと、Renilla もしくはGaussiaレポーターの同時発現での使用はお勧めしません。

Q2 Ready-To-Glowレポーターアッセイには、どんな種類のプレートが利用可能か?
A2 96-、384-、1,536-ウェルプレートがReady-To-Glowアッセイに使用可能です。特に白色プレートをお勧めします。一般的に透明プレートより3.5倍高いRLU(相対発光強度)を示します。化学発光法では、透明プレートは隣接するウェルとクロストークするため適していません。黒色プレートも同様に使用できますが、RLUは白いものより低い値を示します。

Q3 DMSO存在下で分泌型Metridiaルシフェラーゼは安定か?
A3 分泌型Metridiaルシフェラーザは2%までのDMSO存在下で安定です。

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Q4 Ready-To-Glowレポーターアッセイのworking solutionを細胞培養に直接添加してもよいか?
A4 はい、可能です。その際は測定値が測定範囲内となるようにしてください。

Q5 Ready-To-Glowレポーターアッセイのworking solutionを調整後、保存できるか?
A5 Working solutionは新しいうちに使用することが望ましいが、-20℃で1ヵ月、もしくは4℃の暗所で数日間保存することが可能です。

Q6 Ready-To-Glow Reporter Assayで細胞溶解液を使用可能か?
A6 Metridiaルシフェラーゼは効率的に分泌されるタンパク質のため、細胞溶解液でのアッセイは推奨しません。Metridiaルシフェラーゼは分泌型タンパク質のため、細胞を溶解する必要はありません。

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Q7 分泌型Metridiaルシフェラーゼは37℃で何時間、安定か?
A7 分泌型Metridiaルシフェラーゼは37℃で非常に安定です。37℃で72時間後でも、85%の活性を保持します。

Q8 分泌型Metridiaルシフェラーゼの検出に必要な細胞数は?
A8 96ウェルプレートの場合、1ウェルあたり200~300個のMetridiaルシフェラーゼ発現細胞があれば検出が可能です。

Q9 分泌型Metridiaルシフェラーゼの検出限界は?
A9 検出限界は2 fg/well(96ウェルプレート)、または40 fg/mlです。

Q10 分泌型MetridiaルシフェラーゼにおけるZ’値(標準化正規変数)はどの程度か?
A10 分泌型MetridiaルシフェラーゼのZ’値は0.66で、低い変動性と高いダイナミックレンジを示しています。

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Q11 分泌型Metridiaルシフェラーゼ活性の直線性は?
A11 分泌型Metridiaルシフェラーゼは非常に広い範囲の濃度で直線性を示し、少なくとも6桁のダイナミックレンジを示します。

Q12 分泌型レポーターアッセイの後でできる実験は?
A12 細胞を生かしたままアッセイするので、同じ細胞から追加データを得ることができます。
同じ細胞を用いたタイムコース実験や異なる誘導物質、阻害物質を用いたアッセイが可能です。動態研究、毒性や細胞生存率試験、顕微鏡観察、免疫細胞化学分析、タンパク質やRNA解析などを行うこともできます。

Q13 分泌型Metridiaルシフェラーゼを他のレポーターと組み合わせて使うことができるか?
A13 Ready-To-Glow Dual 分泌型レポーターシステムは分泌型Metridiaルシフェラーゼに加え、分泌型ヒト胎盤由来アルカリフォスファターゼ(SEAP)を含んでいます。両レポーターを共発現させ、MetridiaルシフェラーゼもしくはSEAP、またはその両方を誘導すると、プロモーター特異的に、両レポーター活性を培養液上清から直接測定できます。2種類のプロモーターや応答配列についての解析や、1つのレポーターを形質転換効率の測定に使用することができます。また、蛍光レポーターを用いて、多重Ready-To-Glowを行うこともできます。蛍光、化学発光、吸光度を測定することができるマルチモードプレートリーダーを用いて、実験目的に応じてレポーターを組み合わせることができます。

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Q14 なぜ、分泌型レポーターアッセイではバックグラウンドが低いのか?
A14 挿入した目的プロモーターがリークしやすい場合、形質転換後からレポーターが発現してしまいます。このため、非分泌型のレポーターでは実際にアッセイを開始するまでに細胞内にレポーターが蓄積することにより、高いバックグラウンドの要因となります。一方、分泌型のレポーターは培地に分泌されるため、実験を始める前に培地交換を行えば、リークの影響を考えることなく実験を行えます。
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