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Protocols

TaKaRa LA Taq®

Cool Start™法

Cool Start法を行うことにより、特別な酵素や試薬を使用することなく簡便にPCRの際の非特異的な増幅を抑えることができる。
■ 操作
  1. 試薬を全て氷上に置いておく。
  2. 試薬分注後の反応チューブは、すぐに氷上に置く。(チューブに加える試薬の順番は問題にならない。調製後30分たってから反応を行っても大丈夫である。)
  3. サーマルサイクラーはスタートするだけの状態にしておく。(設定は既存のプログラムでOK。) サンプル数が多い場合は、サンプルブロックをあらかじめ4℃にセットしておく。
  4. 反応チューブをサーマルサイクラーにセットし、即スタートする。
Cool Start法とHot Start法の比較

Cool Start法とHot Start法とを比較した。さらにA社の推奨するHot Start専用rTaqの方法も比較した。
図1からわかるように、Hot Start法よりもより簡便なCool Start法とTaKaRa Ex Taqを用いることでより高い増幅効率とfidelityを実現できる。


図1 Cool Start法によるPCRの比較

PCR反応条件

【TaKaRa Thermal Cycler480使用】
94℃、1 min.
60℃、1 min.
40 cycles
 ↓ 60℃、10 min.
3% NuSieve 3:1 agarose
各8 μl泳動
Template:HIV-1 positive control DNAとヒトゲノムDNAのMixture
Lane M φX174-Hinc IIdigest
Lane 1, 4 室温調製
Lane 2, 5 AmpliWaxによるHot Start法
Lane 3 室温調製 + 95℃、9 min pre-incuvation (A社プロトコール推奨)
Lane 6 Cool Start法
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