この画面を閉じる

Protocols

5'-Full RACE Core Set

Standard Protocol
 (5'-Full RACE Core Set)

1.1st strand cDNAの合成
■ 反応液組成
polyA RNA or Total RNA0.5~5 μg
10×RT Buffer1.5 μl
RNase Inhibitor (40 U/μl)0.5 μl
AMV Reverse Transcriptase XL (5 U/μl)1 μl
5'末端リン酸化 RT-プライマー* (200 pmol/μl)1 μl
RNase free dH2Oup to 15 μl
* RT-プライマーは、ライゲーションの際に必要であるため5'リン酸化したものを用いる。合成時にリン酸化しておくとよい。また、12~15 merの長さのものが適している。
■ 操作手順
  1. 上記反応液を調製する。
  2. TaKaRa PCR Thermal Cycler Diceにセットし、以下の条件で反応を行う。
    30℃、10 min

    50℃、30~60 min

    80℃、2 min

    4℃
2.Hybrid RNAの分解
■ 反応液組成
1st strand cDNA溶液15 μl
5×Hybrid RNA Degradation Buffer15 μl
滅菌精製水45 μl
Total75 μl

■ 操作手順
  1. 上記反応液を調製する。
  2. RNase Hを1 μl加え、30℃で1時間反応を行う。
  3. 反応終了後、エタノール沈殿を行う。
3.ライゲーション反応による一本鎖cDNAの環化(コンカテマー化)
■ 反応液組成
5×RNA (ssDNA) Ligation Buffer8 μl
滅菌精製水12 μl
Total20 μl

■操作手順
  1. 上記反応液を調製する。
  2. エタノール沈殿により回収した一本鎖cDNAの沈殿に上記反応液を加えてよく混和する。
  3. 40% PEG #6000 20 μlを加える。
  4. T4 RNA Ligaseを1 μl加えて16℃で一晩(15~18時間)反応を行う。
  5. 反応を開始するまで-20℃で保存。
4.PCRによる増幅反応

PCR反応は、TaKaRa Taq(製品コード R001)、TaKaRa EX Taq(製品コード RR001)、TaKaRa PCR Amplification Kit(製品コード R011)、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2.1(製品コード RR013)、Premix TaqTaKaRa Taq Version 2.0)(製品コード R004A)、Premix TaqEX Taq Version 2.0)(製品コード RR003)、One Shot LA PCR Mix(製品コード RR004)のいずれを用いても行うことが可能である。通常、TaKaRa Taqを用いた反応で大丈夫だが、目的とするターゲットの鎖長が長い場合や、高い増幅効率を望まれる場合は、TaKaRa EX Taq あるいはTaKaRa LA PCR Kit Ver. 2.1を使用した場合の方が良好な結果が得られると思われる。


<TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2.1を用いた反応例>

ライゲーション反応の終わったサンプルをTE bufferにて10倍希釈したものをtemplateとして使用し、反応を行う。

(1)1st PCR反応
■ 反応液組成
template1 μl
10×LA PCR Buffer II(Mg2+plus)5 μl
dNTP Mixture(各2.5 mM)8 μl
1st PCR用primer S1(20 pmol/μl)0.5 μl
1st PCR用primer A1(20 pmol/μl)0.5 μl
TaKaRa LA Taq(5 U/μl)0.5 μl
滅菌精製水up to 50 μl

■ 操作手順
  1. 上記反応液を調製する。
  2. TaKaRa PCR Thermal Cycler Diceにセットし、以下の条件で反応を行う。
    94℃、3 min
    94℃、30 sec25 cycles
    50~65℃、30 sec
    68~72℃、0.5~5 min

(2)2nd PCR反応
■ 反応液組成
1st PCR solution*11 μl
10×LA PCR Buffer II(Mg2+plus)5 μl
dNTP Mixture(各2.5 mM)8 μl
2nd PCR用primer S2(20 pmol/μl)0.5 μl
2nd PCR用primer A2(20 pmol/μl)0.5 μl
TaKaRa LA Taq(5 U/μl)0.5 μl
滅菌精製水up to 50 μl

*1 鮮明なPCR増幅産物を得るためには、1st PCR反応液の原液、10倍希釈液、100倍希釈液の、それぞれ1 μlを2nd PCR溶液に加え、3通りのPCRを行うことを推奨する。


■ 操作手順
  1. 上記反応液を調製する。
  2. TaKaRa PCR Thermal Cycler Diceにセットし、以下の条件で反応を行う。
    94℃、30 sec25~30 cycles
    50~65℃、30 sec
    68~72℃、0.5~5 min
  3. 反応終了後、反応液の一部を電気泳動し解析を行う。
この画面を閉じる