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Chaperone Plasmid Set(製品コード 3340)


<シャペロン共発現>
有効なシャペロンの種類や培養条件(培地、培養温度、エアレーション条件、誘導のタイミング、誘導剤の濃度、誘導時間など)は目的タンパク質によって異なります。以下に一般的な使用例を示しますが、目的タンパク質に応じて至適条件を検討されることをお勧めします。

【1. 共発現系の構築】

目的タンパク質とシャペロンの共発現系の構築は、まずシャペロンプラスミドで 形質転換した大腸菌を作製し、その後、目的タンパク質の発現プラスミドで 形質転換する2段階の方法が効果的です。
なお、シャペロンプラスミドと目的タンパク質の発現プラスミドを同時に形質転換する1段階法や、発現プラスミドで形質転換した後にシャペロンプラスミドで形質転換する2段階法は、経験的に形質転換効率が非常に低くなるため、おすすめできません。

  1. 大腸菌発現用の、目的タンパク質の発現プラスミドを構築する。

  2. 発現用の宿主大腸菌を培養し、常法に従ってコンピテントセルを調製する。(あるいは市販のコンピテントセルを用いてもよい。)

  3. 2.で調製したコンピテントセルを本キットのプラスミドのいずれかで形質転換し、クロラムフェニコール(20 μg/ml)を含む選択培地プレート上で 形質転換体を選択する。(プラスミド使用量は、1回の形質転換あたり 1μl が 目安)

  4. シャペロンプラスミドの形質転換体をクロラムフェニコール(20 μg/ml)を含む 液体培地上で培養し、常法に従いコンピテントセルを調製する。

  5. 4. で調製したコンピテントセルを目的タンパク質の発現プラスミドに より再度形質転換し、 クロラムフェニコール(20μg/ml)と発現プラスミド選択用の薬剤を含む選択 プレート上で生育する形質転換体を選択する。

【2. 共発現実験】

以下に、lacプロモーターの下流に目的遺伝子を挿入した pUC系プラス ミド(アンピシリン耐性マーカー)と本キットのシャペロン共発現の実験例を 示します。さらに詳細な培養条件については文献をご参考に、 条件検討を行なってください。

  1. 共発現大腸菌を、プラスミド選択用に20 μg/mlクロラムフェニコール と50 μg/mlアンピシリン、およびシャペロン発現誘導用に0.5~4 mg/ml L-アラビノースおよび(あるいは)1~10 ng/mlテトラサイクリン*を含むL培地に接種し、30~37℃で培養する。pGKJE8の場合はL-アラビノースとテトラサイクリンの両方、pGro7、pKJE7、pTf16 の場合は L-アラビノースのみ、pG-Tf2の場合はテトラサイクリンのみを用いる。
    * 低濃度のテトラサイクリンは、大腸菌の生育に大きな影響は与えない。

  2. 培養液のOD600が、0,4~0.6になった時点で、終濃度 0,1~1 mMとなるようにIPTGを添加し、さらに1~4時間30~37℃にて培養する。

  3. 培養終了後、SDS-PAGEや活性測定などにより、目的産物の 発現量や可溶化量を測定し、培養条件(培地、培養温度、エアレーション条件、 誘導のタイミング、誘導剤の濃度、誘導時間など)の至適化を検討する。



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