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Protocols

DNA Ligation Kit <Mighty Mix>

【4】Linker Ligation, Adaptor Ligationの場合

プラスミドベクターにリンカーを挿入する場合
プラスミドベクターへの外来DNAの挿入方法に準ずる。
脱リン酸化ベクターにリン酸化リンカーを挿入する場合は、リン酸化リンカーをベクターの10~1,000倍量 (モル比) を加えて反応する。脱リン酸化していないベクターを用いる場合には、100倍以上のリンカーを加えて反応を行う。
DNA断片の両末端にリンカー (またはアダプター) を結合する場合(cDNAリンカーライゲーションなど)
(1) 結合したいDNAフラグメント (10~100 fmol)と、その100倍量以上のリンカー (またはアダプター) (モル比) を加えた溶液 5~10 μlを用意する。
(2) (1)のDNA溶液の2倍容量 (10~20 μl) のLigation Mixを加えよく混合し、16℃で30分間反応させる。*1
(3) その後、制限酵素での切断を行う場合は、一度エタノール沈殿によりDNAを回収し、バッファー交換した後に行う。

*1 リンカーが不安定な構造 (AT配列が多い、短い (~8 base)リンカー) の場合には、反応温度を下げて(<10℃) 1 ~ 2 時間反応してください。
<使用例> プラスミドベクターへのリンカーの挿入
pUC118 Hinc II/BAP、脱リン酸化済みベクター(製品コード 3322)(50 ng, 25 fmol)に、130 ng (25 pmol)の pBgl IIリンカー pd(CAGATCTG) (製品コード 4621P;終売)を加え、10 μlとしたDNA溶液を調製した。プロトコールに従って、16℃で 30分間反応した。この反応液の一部でE.coli JM109コンピテントセル (8.4×108 cfu/μg pUC118) 100 μlを形質転換し、X-Gal、IPTGを含む L-ampプレート上でコロニーを形成させ、コロニー数を計測して形質転換効率を調べた。

Linker / Vectorモル比cfu (White) /μg vector
05.3×105
10004.5×107
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