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Protocols

PrimeScript™ RT-PCR Kit

PrimeScript™ RT-PCR Kitの操作方法(製品コード RR014A)

  1. 鋳型RNAの変性および逆転写反応

    A-1. 下記に示す反応液を調製する。
    試薬使用量
    dNTP Mixture(10 mM each) 1 μl
     Oligo dT Primer (2.5 μM)
    or Random 6 mers(20 μM)
       or Specific Primer(2 μM)*1
    1 μl
    Template RNA*2
     or Positive Control RNA

    4×105 copies
    RNase Free dH2O up to 10 μl

    *1 反応に用いるプライマーはOligo dT Primer、Random 6 mers、特異的下流プライマー(Control RNA の場合はR-1 Primer)のいずれかを選択。
    *2 Template RNAは、8 μlまで持ち込むことができる。total RNAの場合、5 μgまで使用できる(推奨使用量:100 pg~1 μg)。

    A-2. 調製済みのチューブをサーマルサイクラーにセットし、次のプログラムで変性・アニーリングを行う。

       65℃、5 min.
       4℃

    <重要>この変性・アニーリング操作により、鋳型RNAの変性と、逆転写プライマーの鋳型RNAへの特異的なアニ-リングが効率的に行われ、逆転写効率が向上する。

    A-3. 変性・アニーリング済み反応液に以下のように試薬を添加する。
    試薬 使用量
    A-2 の変性・アニーリング済み反応液 10 μl
    5 × PrimeScript Buffer 4 μl
    RNase Inhibitor 0.5 μl
    PrimeScript RTase 0.5 μl
    RNase Free dH2O 5 μl
    Total volume 20 μl

    A-4. チューブをサーマルサイクラーにセットし、次のプログラムで逆転写反応を行う。
    (30℃
    10 min. )*3
    42℃(~ 50℃) 15~30 min.
    95℃ 5 min.*4
    4℃

    *3 逆転写反応にRandom 6 mersを用いる場合、42℃(~50℃)での反応の前に追加で行う。この操作によりRandom 6 mersが42℃(~50℃)で鋳型RNAと充分アニーリングできる長さになるまで伸長し、逆転写効率が向上する。
    *4 長鎖を増幅する場合は、1stストランドcDNAにニックなどのダメージを与えないように、70℃、15 minの失活操作を行うこと。

    <重要> PrimeScript RTaseは、高次構造にも強い伸長性を示すので、通常の反応は42℃で行う。特異的下流プライマーを逆転写プライマーとして使用した場合、ミスプライミングによる非特異的な増幅産物が生じることがある。そのような場合は、反応温度を50℃にすることで改善が見られる。


  2. PCR反応

    B-1. 下記に示す反応液を調製する。
    試薬使用量 最終濃度
    [または反応系に加える量]
    10×PCR Buffer II 5 μl
    dNTP Mixture(10 mM each) 2 μl 400 μM
    上流Primer(20 μM)*5(センス) 0.5 μl 0.2 μM
    下流Primer(20 μM)*6(アンチセンス) 0.5 μl 0.2 μM
    TaKaRa Ex Taq HS 0.5 μl 2.5 U
    A-4 の逆転写反応液 ≦ 5 μl
    滅菌水 up to 50 μl

    *5 Positive Control RNAの場合、F-1 Primer
    *6 Positive Control RNAの場合、R-1 Primer

    B-2. 調製したチューブをサーマルサイクラーにセットし、至適プログラムでPCRを行う。


    一般的な反応条件
    (A) 3 step PCRの場合 (B) 2 step PCRの場合
    94℃
    55~65℃
    72℃
     30 sec.
     30 sec.
     1 min./kb
     
    30 cycles 98℃
    68℃
     10 sec.
     1 min./kb
     
    30 cycles

    Positive Control RNAの場合*7
    94℃
    60℃
    72℃
     30 sec.
     30 sec.
     1 min
     
    30 cycles

    *7 逆転写反応にOligo dT Primer、Random 6 mers、R-1 Primerのいずれを用いた場合も、Control Primer F-1とR-1を用いたPCRで、462 bpの増幅産物が得られる。
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