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Protocols

One Step TB Green® PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time)

Thermal Cycler Dice® Real Time Systemシリーズを用いる場合の操作方法

One Step TB Green™ PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time)(製品コード RR086A/B)

1. 下記に示す反応液を氷上で調製する。

<1反応あたり>
試薬使用量最終濃度
2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 412.5 μl
PrimeScript 1step Enzyme Mix 21.0 μl
PCR Forward Primer(10 μM) 1.0 μl0.4 μM *1
PCR Reverse Primer(10 μM)1.0 μl0.4 μM *1
total RNA2.0 μl*2
RNase Free dH2O7.5 μl 
Total25 μl 

*1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.2~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

*2 total RNA 10 pg~100 ngをtemplateとして使用することが望ましい。


2. 反応チューブまたはプレートを遠心機で軽く遠心後、Thermal Cycler Dice Real Time Systemシリーズにセットし、反応を開始する。

反応は、下記のシャトルPCRの標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。


プログラム
Pattern 1:逆転写反応
Hold
42℃5分
95℃10秒
Pattern 2:PCR反応
Cycle:40
95℃5秒
60℃30秒
Pattern 3:Dissociation


※使用上の注意
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃ (5~)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に逆転写酵素の熱失活を行うには、通常95℃ 10秒で充分です。


3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。

解析方法は、Thermal Cycler Dice Real Time Systemの取扱説明書をご参照ください。

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