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Protocols

腸炎ビブリオ (trh gene) One Shot PCR Kit

検出プロトコール
腸炎ビブリオ (trh gene) One Shot PCR Kit (製品コード RR118A)

A. サンプルの調製例
  1. 菌体を直接PCRにかける場合
    1)プレート(TCBS寒天培地*1など)上のコロニーから、滅菌済みマイクロピペット用チップなどで微量の菌体をとり、滅菌水500 μlに懸濁する。
    2)95℃で5分間、熱処理する。
    3)遠心により残渣を除いた上清5 μlに滅菌精製水20 μlを添加した熱抽出サンプルをPCR反応に用いる。
  2. 培養法を組み合わせて、食品等から菌を回収してPCRを行う場合
    1)被験試料に食塩ポリミキシンブイヨン*2を10倍量加え、細菌検査用ホモジナイザー(ストッカー等)で破砕混合後、37℃で数時間 ~ 一晩培養する。
    2)培養液1 mlを10,000 rpm(約1,000×g)で3分間遠心する。
    3)上清を除去し、沈殿をTE buffer(10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH8.0)500 μlにて懸濁後、95℃、5分間加熱処理する。
    4)遠心分離により残渣を除いた上清5 μlに滅菌精製水20 μl添加したサンプルをPCR反応に用いる。

    上記方法で調製した熱抽出サンプルを用いてPCRを行ったときに反応阻害がかかる場合、さらに希釈してPCR反応サンプルとして用いてください。

    *1 TCBS培地 日水製薬(株)など
    *2 食塩ポリミキシンブイヨン 日水製薬(株)
B. PCR反応
反応液調製・反応条件
正しい検出結果を得るためにNegative control反応を行ってください。
1)2×One Shot PCR solution tubeに調製した熱抽出サンプルを25 μl添加する。
Negative controlとして滅菌精製水を25 μl加えたものを1本用意する。
2)各チューブのキャップをしっかり閉め、サーマルサイクラーにセットして PCR反応を開始する。

【PCR条件】
94℃  2 min.
94℃  30 sec.40 cycles
55℃  1 min.
72℃  1 min.

※ 反応は約3時間で終了する。反応後のサンプルは 4℃、または-20℃で保存可能である。
C. 判定
サンプル中にtrh遺伝子が存在すれば、250 bpの増幅産物(バンド)が検出される。インターナルコントロールは、666 bpの増幅産物が検出される。
サンプル反応の結果は、Negative control反応結果と照らし合わせて判定してください。

[ Negative control 反応の電気泳動結果 ]
 インターナルコントロール由来増幅産物(666 bp)が検出されない。 インターナルコントロール由来増幅産物(666 bp)が検出された。
trh遺伝子由来増幅産物(250 bp)が検出されない。 PCR反応が正常に進まなかった。*1 【4】 コンタミネーションを起こさず、正しくPCR反応が進んだ。 【3】
trh遺伝子由来増幅産物(250 bp)が検出された。 コンタミネーションを起こしていると考えられる。*2 【2】 コンタミネーションを起こしていると考えられる。*2 【1】

[ サンプル反応の電気泳動結果 ]
 インターナルコントロール由来増幅産物(666 bp)が検出されない。 インターナルコントロール由来増幅産物(666 bp)が検出された。
trh遺伝子由来増幅産物(250 bp)が検出されない。 PCR反応が正常に進まなかった。*1 【4】 trh遺伝子は検出限界以下である。 【3】
trh遺伝子由来増幅産物(250 bp)が検出された。 trh遺伝子陽性である。*3 【2】 trh遺伝子陽性である。*3 【1】

【1】~【4】は、下図のレーンをご参照ください。

*1 何らかの原因でPCR反応が正常に行われていない可能性が高いので再反応を行う。
*2 コンタミネーションを起こしていると考えられる。反応液調製場所及び使用した機器を除染したうえですべてのサンプルで再度反応を行う。
*3 Negative control反応の結果が正しい結果が得られた場合にtrh遺伝子陽性と判定される。


※ 100 bp弱の位置に非特異的バンドがみられることがありますが、非特異的増幅によるものなので判定には関係ありません。
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