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Protocols

T4 DNA Ligase

T4 DNA Ligaseによるプラスミドベクターへの外来DNAのライゲーション反応例

操作手順
  1. 以下の反応液を調製する。
    10×ligation buffer*12 μl
    ベクターDNA50 ng
    インサートDNAフラグメント(ベクターDNAのモル比で約3倍量)*2
    T4 DNA Ligase (350 U/μl)1 μl
    滅菌蒸留水
    total20 μl
  2. cohesive末端(粘着末端)の場合、16℃、1~5時間反応する。
    blunt末端(平滑末端)の場合、16℃、1~24時間反応 する。*3
  3. 反応液の一部を形質転換に用いる。*4 反応液を保存する場合は、-20℃で保存する。

*1 T4 DNA Ligase(製品コード 2011A/B)に添付
(660 mM Tris-HCl (pH7.6)、66 mM MgCl2、100 mM DTT、1 mM ATP)
*2 DNAのサイズや、ベクターの脱リン酸化の有無、DNA末端の種類によって、最適のベクター:インサート比は変わりますので、ベクター:インサート=1:1から1:10ぐらいまでの間で検討してください。
*3 ライゲーションされにくい場合は、時間をのばしてください。長時間(16時間以上)反応する場合は、4℃でも反応が行えます。
*4 エレクトロポレーション等必要がある場合は、反応液をフェノール抽出、エタノール沈殿を行ってから、次の反応に用いてください。
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